HPLC-MS／MS法同时测定枫蓼肠胃康合剂、胶囊中10种成分

梁 颖，许文佳，符策奕，陈国彪

（海南省药品检验所，海南 海口 570216）

枫蓼肠胃康是以辣蓼和牛耳枫为原料制成的纯中药制剂，具有理气健胃、除湿化滞等功效［1］，临床上对急慢性肠胃炎、肠易激综合征、溃疡性结肠炎等胃肠道疾病具有显著疗效［2-5］，并且无明显不良反应。国家食品药品监督管理总局颁布的枫蓼肠胃康标准中，以芦丁为含有量指标对其进行质量控制，但中药复方制剂具有多组分、多靶点、协同作用的特点，单一成分难以全面反映其质量和疗效［6］。近年来报道枫蓼肠胃康中的有效成分主要为黄酮［7-10］，并用液相色谱法对其进行定量分析［11-13］；另有学者确定其中含有酚酸类成分，并测定其含有量［14-15］，但迄今尚无同时对黄酮、酚酸等多种成分进行准确定量分析的报道。

高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS／MS）具有较高的专属性和灵敏度，可在较短时间内同时对酚酸、黄酮类成分进行有效分离，并完成准确定性定量分析［16］，大大提高了检测效率。因此，本实验建立该方法同时测定枫蓼肠胃康合剂、胶囊中10种成分（没食子酸、原儿茶酸、芦丁、金丝桃苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷、槲皮素、芹菜素、山柰酚、异鼠李素）的含有量，以期全面评价该复方质量。

1 材料

1.1 仪器 U3000 液相色谱仪（美国Thermo公司）；API4000＋质谱仪，配置AB SCIEX质谱工作站（美国AB公司）；Mili-Q 超纯水器（美国Millipore公司）；XS205DU 电子分析天平（德国Sartorius公司）；SK8210HC 超声波提取仪（上海科颉贸易有限公司）。

1.2 试药 枫蓼肠胃康合剂（海南万州制药有限公司，批号 151001、151102、151103、151201、160101、160102）；枫蓼肠胃康胶囊（海口奇力制药股份有限公司，批号 S141201、S141202、S141203）。没食子酸（批号 110831-201605，含有量 90.8%）、原儿茶酸（批号 110809-200503）、芦丁（批号 100080-201610，含有量 91.9%）、金丝桃苷（批号 111521-201708，含有量 95.1%）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（批号111207-201602，含有量90.8%）、槲皮苷（批号 111538-200302）、槲皮素（批号 100081-201509，含有量 98.1%）、山柰酚（批号 110860-201310，含有量 93.2%）、芹菜素（批号111901-201102，含有量 99.6%）、异鼠李素（批号 110860-201410，含有量 99.9%）对照品均购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈、乙酸为色谱纯；水为超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm）。有机滤膜（尼龙，0.22 μm）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取没食子酸、原儿茶酸、芦丁、金丝桃苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷、槲皮素、芹菜素、山柰酚、异鼠李素对照品适量，甲醇分别制成 1.107、1.087、1.130、0.976、1.265、1.072、1.146、0.456、0.813、0.092 7 mg／mL 贮备液，分别精密吸取 2、10、10、1、10、5、1、2、1、10 mL，置于同一 100 mL 量瓶中，甲醇分别稀释成 0.022 1、0.108 7、0.113 0、0.009 76、0.126 5、0.053 6、0.011 5、0.009 12、0.008 13、0.009 27 mg／mL，即 得，于 4 ℃ 下保存。

2.2 供试品溶液制备 精密量取2 mL 合剂于50 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，精密量取1 mL 于 10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，即得（用于测定芦丁、没食子酸）。再取胶囊内容物适量，混匀，精密称取 0.4 g，置于 50 mL 量瓶中，加 40 mL 甲醇超声 20 min，放冷，甲醇定容至刻度，摇匀，精密量取 2 mL，置于10 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（用于测定芦丁、没食子酸）。上机测定前，溶液均用 0.22 μm 微孔滤膜过滤。

2.3 色谱条件 Luna C8色谱柱（2 mm×100 mm，3 μm）；流动相乙腈（A）-水（B）（含 0.1% 乙酸），梯度洗脱（0～2 min，5%A；2～4 min，5%～20%A；4～6 min，20%A；6～12 min，20%～30%A；12～17 min，30%A；17～23 min，30%～5%A；23～30 min，5% A）；柱温 35 ℃；体积流量0.3 mL／min；进样量 1 μL。

2.4 质谱条件 电喷雾负离子模式，多反应监测（MRM）；离子喷雾负电压 4.5 kV；离子源温度450 ℃；帘气 15 kPa；碰撞气氮气；雾化气45 kPa；辅助气 45 kPa，质谱参数见表1，总离子流色谱图见图1。

表1 各成分质谱参数Tab.1 MS parameters for various constituents

2.5 方法学考察

图1 各成分总离子流色谱图Fig.1 Total ion current chromatograms of various constituents

2.5.1 线性关系考察 取 “2.1”项下贮备液适量，50%甲醇制成系列质量浓度对照品溶液，在“2.3”～“2.4”项条件下进样测定。以色谱峰峰面积为纵坐标（Y），溶液质量浓度为横坐标（X）进行回归，以 S／N=10 为定量限，S／N=3 为检测限，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.5.2 精密度试验 取 “2.5.1”项下中间质量浓度的对照品溶液，在 “2.3”～“2.4”项条件下进样测定 6 次，测得没食子酸、原儿茶酸、芦丁、金丝桃苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷、槲皮素、芹菜素、山柰酚、异鼠李素峰面积 RSD分别为6.55%、6.30%、6.29%、5.59%、6.89%、5.67% 、6.24% 、6.75% 、6.75% 、4.23% ，表 明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性试验 取合剂（批号151201）、胶囊（批号 S141201）适量，按 “2.2”项下方法制备供试品溶液各 6 份，在 “2.3”～“2.4”项条件下进样测定，测得合剂供试品溶液中没食子酸、原儿茶酸、芦丁、金丝桃苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷、槲皮素、芹菜素、山柰酚、异鼠李素含有 量 RSD 分 别 为 4.90%、2.95%、6.47%、5.23% 、7.55% 、7.47% 、5.19% 、3.31% 、5.60% 、5.28%，胶囊供试品溶液中分别为4.93%、7.87%、6.40% 、7.10% 、8.91% 、3.44% 、6.54% 、6.88% 、7.91%、7.55%，表明该方法重复性良好。

2.5.4 稳定性试验 取合剂（批号151201）、胶囊（批号 S141201）适量，按 “2.2”项下方法制备供试品溶液，室温下于 0、2、4、8、12、24 h在 “2.3”～“2.4”项条件下进样测定，测得合剂供试品溶液中没食子酸、原儿茶酸、芦丁、金丝桃苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷、槲皮素、芹菜素、山柰酚、异鼠李素含有量 RSD 分别为5.15% 、5.62% 、6.37% 、5.50% 、6.68% 、4.88% 、2.21% 、5.34% 、7.27% 、6.88% ，胶 囊供试品溶液中分别为 3.98%、6.30%、5.37%、6.28% 、7.73% 、4.27% 、8.54% 、6.46% 、7.47%、7.22%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.5 加样回收率试验 精密移取合剂（批号151201）1 mL，置于 50 mL 量瓶中，精密加入“2.1”项下对照品溶液适量（使对照品加入后成分含有量与测定成分原含有量的比例约为80%、100% 、120% ），平行 3 份，按 “2.2”项下方法制备供试品溶液 A，在 “2.3”～“2.4”项条件下进样测定，计算 8种成分（芦丁、没食子酸除外）回收率；同法制备供试品溶液B，计算芦丁、没食子酸回收率。结果，没食子酸、原儿茶酸、芦丁、金丝桃苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷、槲皮素、芹菜素、山柰酚、异鼠李素平均加样回收率分别为101.7%、104.0%、101.3%、100.4%、95.4%、99.5% 、102.0%、100.4% 、102.0% 、101.4%，RSD分别为3.5%、6.4%、8.7%、8.0%、8.0%、4.3%、5.2%、7.5% 、6.2% 、5.7%。

精密称取胶囊（批号S141201）内容物0.2 g，置于50 mL 量瓶中，精密加入 “2.1”项下对照品溶液适量（使对照品加入后成分含有量与测定成分原含有量比例约为 80%、100%、120%），平行3 份，按 “2.2”项下方法制备供试品溶液 A，在“2.3”～“2.4”项条件下进样测定，计算 8种成分（芦丁、没食子酸除外）回收率；同法制备供试品溶液B，计算芦丁、没食子酸回收率。结果，没食子酸、原儿茶酸、芦丁、金丝桃苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷、槲皮素、芹菜素、山柰酚、异鼠李素平均加样回收率分别为 101.6%、103.6% 、99.3% 、96.8% 、99.9% 、101.7% 、100.7%、102.6%、98.2%、98.7%，RSD 分别为3.6% 、7.0% 、7.6% 、8.9% 、4.4% 、5.5% 、6.1% 、4.6% 、6.2% 、7.1% 。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5.6 样品含有量测定 取合剂6 批（批号151001、151102、151103、151201、160101、160102）、胶囊 3批（S141201、S141202、S141203），按 “2.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.3”～“2.4”项条件下进样测定，计算含有量，结果见表3。

表3 各成分含有量测定结果（n=3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（n=3）

3 讨论

3.1 色谱柱选择 文献中通常采用C18色谱柱分离成分，但预实验发现该色谱柱下槲皮素、山柰酚色谱峰拖尾严重，山柰酚、芹菜素、异鼠李素色谱峰分离度不理想，而采用C8色谱柱时各色谱峰分离度比较理想，峰形尖锐对称，故选择其作为分离柱。

3.2 色谱、质谱条件优化 由于10种成分中有一些性质接近，故选择梯度洗脱方式，可使所有成分得到完全分离。本实验分别考察甲醇-水、乙腈-水、甲酸-水、乙酸-水、乙酸铵-水的分离效果，发现流动相为甲醇-水时色谱峰噪音较大，响应值偏低，故选择乙腈-水，为了改善待测成分色谱峰峰形，又在流动相中加入一定量酸，最终确定流动相为乙腈-水（含 0.1% 乙酸），此时峰形良好，在17 min内可洗脱出所有成分，从而提高了分离效率。在研究离子扫描模式时发现，黄酮、酚酸类成分在负离子模式下的响应值较高，基于山柰酚灵敏度相对偏低，故提高其驻留时间为100 ms。

3.3 含有量分析 在6 批枫蓼肠胃康合剂、3 批枫蓼肠胃康胶囊中，芦丁含有量最高，并且不同批次样品中各成分含有量存在一定差异，这可能与工艺生产过程中投料药材来源、产地、采收期等，以及不同厂家煎煮、浓缩等环节中温度、湿度控制存在差异有关［17-18］。

4 结论

本实验建立HPLC-MS／MS 法同时测定枫蓼肠胃康合剂、胶囊中没食子酸、原儿茶酸、芦丁、金丝桃苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷、槲皮素、芹菜素、山柰酚、异鼠李素的含有量，该方法高效快速，准确可靠，可为该制剂质量控制提供新的参考方法。