HPLC法测定芩杏清热止咳颗粒中8种成分

王子凌云，梁 琨∗，李国文

（1.上海中医药大学，上海 201203；2.上海中医药大学附属上海市中西医结合医院，上海 200082）

芩杏清热止咳颗粒由黄芩清肺汤加减而来，是课题组开发的复方中药新药，黄芩清肺汤源于元代罗天益所著 《卫生宝鉴》 卷十七，由黄芩、栀子2味药组成，主治肺燥所致的小便不通；芩杏清热止咳颗粒由黄芩、栀子、桑叶、苦杏仁、甘草等中药提取制备而成，具有清肺泻热、止咳平喘的功效，主治肺热咳喘证。方中黄芩具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等作用［1-4］，黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素等黄酮类成分是其主要有效成分；甘草主要含甘草苷、异甘草苷等黄酮类成分，以及甘草酸等皂苷类成分，具有抗炎、抗病毒、调节心脑血管系统等作用［5-7］；栀子具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒等作用，其中环烯醚萜类成分栀子苷在栀子中含有量最高，也是活性物质，可作为该药材质量控制的重要指标，具有降低缺血对脑组织伤害［8］、保肝利胆［9］、清除羟自由基、抑制脂质过氧化等作用［10］；苦杏仁具有镇咳平喘［11］、抗炎镇痛等作用［12］；桑叶具有降低血糖、抗氧化等作用［13-14］。

本实验建立HPLC 法测定芩杏清热止咳颗粒中黄芩、栀子、甘草主要有效成分黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素、栀子苷、甘草苷、异甘草苷、甘草酸的含有量，以期用于该制剂更全面的质量控制，并确保其内在质量，更好地服务于临床。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 型高效液相色谱仪，配置G1329B 自动进样器、G1311B 四元泵、G1316A 检测器；AL104 电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；DL-120D 智能超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）；Milli-Q 超纯水机（美国 Millipore公司）。

1.2 试药 汉黄芩素（B20489）、汉黄芩苷（B20488）、栀子苷（B21661）、甘草酸（B20417）对照品均购于上海源叶生物科技有限公司；异甘草苷（DR10672）对照品购于上海鼎瑞化工有限公司；黄芩素（05-2001）、甘草苷（05-1016）对照品购于上海中药标准化研究中心；黄芩苷（110715-201016）对照品购于中国食品药品检定研究院。芩杏清热止咳颗粒（批号171015、171021、171026）。甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸等试剂均为分析纯，均购于国药集团化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素含有量测定

2.1.1 色谱条件 Diamonsil Plus C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相 0.2% 磷酸（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～10 min，45% B；10～25 min，45%～55%B；25～28 min，55%～70%B；28～35 min，70%B；35～36 min，70%～45%B；36～45 min，45%B）；体积流量 1.0 mL／min；柱温25 ℃；检测波长 274 nm；进样量 10 μL。

2.1.2 溶液制备

2.1.2.1 对照品溶液 精密称取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品适量，甲醇分别稀释成 156.800、31.200、4.592、3.776 μg／mL，即得。

2.1.2.2 供试品溶液 精密称取颗粒约0.1 g，置于 50 mL 具塞锥形瓶中，精密加入 70% 乙醇25 mL，密塞，称定质量，超声（250 W、40 kHz）提取45 min，放冷，70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，续滤液过 0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.1.2.3 阴性样品溶液 取缺黄芩的阴性样品适量，按 “2.1.2.2”项下方法制备，即得。

2.1.3 系统适用性试验 取 “2.1.2”项下各溶液适量，在 “2.1.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由图可知，各成分色谱峰分离度均大于1.5，理论塔板数大于6 000，阴性无干扰。

图1 各成分HPLC 色谱图（Ⅰ）Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents（Ⅰ）

2.1.4 线性关系考察 取 “2.1.2.1”项下对照品溶液 1、2、5、10、20 μL，在 “2.1.1”项色谱条件下进样测定。以进样量（X）对峰面积（Y）进行线性回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内呈良好的线性关系。

表1 各成分线性关系（Ⅰ）Tab.1 Linear relationships of various constituents（Ⅰ）

2.1.5 精密度试验 取 “2.1.2.1”项下对照品溶液，在 “2.1.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积RSD 分别为 0.20%、0.42%、0.83%、0.51%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取 “2.1.2.2”项下供试品溶液（批号 171015）适量，于 0、4、8、12、20、24 h 在 “2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积 RSD分别为 0.28%、1.7%、1.5%、1.0%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 精密称取颗粒（批号171015）约0.1 g，共6 份，按 “2.1.2.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素含有 量 RSD 分 别为 1.2%、1.5%、1.7%、1.4%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取含有量已知的颗粒（批号 171015）约 0.05 g，共 6 份，精密加入各对照品溶液（0.51 mg／mL 黄芩苷 4 mL、0.25 mg／mL汉黄芩苷 1 mL、0.039 0 mg／mL 黄芩素 1 mL、0.021 mg／mL 汉黄芩素 1 mL），按“2.1.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。

表2 各成分加样回收率试验结果（Ⅰ， n=6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（Ⅰ， n=6）

2.2 栀子苷、甘草苷、异甘草苷、甘草酸含有量测定

2.2.1 色谱条件 Diamonsil Plus C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相 0.05% 磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～15 min，13% B；15～20 min，13%～20% B；20～25 min，20% B；25～37 min，20%～50%B；37～43 min，50%～90%B；43～50 min，90%～13% B）；体积流量1.0 mL／min；柱温 25 ℃；检测波长 0～25 min，237 nm；25～33 min，360 nm；33～50 min，237 nm；进样量 10 μL。

2.2.2 溶液制备

2.2.2.1 对照品溶液 精密称取栀子苷、甘草苷、异甘草苷、甘草酸对照品适量，甲醇分别稀释成181.5、22.7、20.3、60.8 μg／mL，即得。

2.2.2.2 供试品溶液 精密称取颗粒约0.3 g，置于 50 mL 具塞锥形瓶中，精密加入 70% 乙醇25 mL，密塞，称定质量，超声（250 W、40 kHz）提取30 min，放冷，70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，过 0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.2.2.3 阴性样品溶液 取缺栀子、甘草、栀子、甘草的阴性样品适量，按 “2.2.2.2”项下方法制备，即得。

2.2.3 系统适用性试验 取 “2.2.2”项下各溶液适量，在 “2.2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图2。由图可知，各成分色谱峰分离度均大于1.5，理论塔板数大于6 500，阴性无干扰。

2.2.4 线性关系考察 取 “2.2.2.1”项下对照品溶液 1、2、5、10、20 μL，在 “2.2.1”项色谱条件下进样测定。以进样量（X）对峰面积（Y）进行线性回归，结果见表3，可知各成分在各自范围内呈良好的线性关系。

表3 各成分线性关系（Ⅱ）Tab.3 Linear relationships of various constituents（Ⅱ）

2.2.5 精密度试验 取 “2.2.2.1”项下对照品溶液，在 “2.2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得栀子苷、甘草苷、异甘草苷、甘草酸峰面积RSD 分别为 0.77%、0.99%、0.93%、0.96%，表明仪器精密度良好。

图2 各成分HPLC 色谱图（Ⅱ）Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents（Ⅱ）

2.2.6 稳定性试验 取 “2.2.2.2”项下供试品溶液（171015）适量，于 0、4、8、12、20、24 h在 “2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得栀子苷、甘草苷、异甘草苷、甘草酸峰面积 RSD 分别为0.55%、1.2%、1.7%、1.2%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 精密称取颗粒（171015）约0.3 g，共 6 份，按 “2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得栀子苷、甘草苷、异甘草苷、甘草酸含有量RSD 分别为 0.67%、1.3%、1.2%、0.89%，表明该方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取含有量已知的颗粒（171015）约 0.15 g，共6 份，精密加入对照品溶液 2 mL（0.85 mg／mL 栀子苷、0.09 mg／mL甘草苷、0.078 mg／mL 异甘草苷、0.29 mg／mL 甘草酸），按 “2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表4。

表4 各成分加样回收率试验结果（Ⅱ， n=6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（Ⅱ， n=6）

2.3 样品含有量测定 取3 批颗粒剂（171015、171021、171026），每批 3 份，按 “2.1.2.2”和“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.1.1”和 “2.2.1”项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表5。

3 讨论

3.1 指标成分选择 芩杏清热止咳颗粒中黄芩清上焦肺热，为君药，含有大量黄酮，是该药材的药效物质基础，目前已发现黄芩苷、黄芩素等黄酮及其苷类成分40 多种［15］，本实验选择含有量较高的黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素；环烯醚萜是栀子属植物中的特征性成分，在芩杏清热止咳颗粒中栀子苷含有量较高，可作为质控成分；2015年版 《中国药典》 将甘草苷、甘草酸作为质控成分，是甘草清热解毒、祛痰止咳的主要活性物质［16］，而不同品种、产地药材中异甘草苷含有量差异较大，故本实验将甘草苷、异甘草苷、甘草酸一同作为指标成分。

表5 各成分含有量测定结果（mg／g， n=3）Tab.5 Results of content determination of various consitituents（mg／g， n=3）

由于芩杏清热止咳颗粒中各成分含有量、化学性质差异较大，同一提取浓度、相同色谱分离条件无法同时准确测定，故本实验采用2种提取浓度、2种色谱条件分别测定。同时，桑叶中芦丁、绿原酸，以及苦杏仁中苦杏仁苷等成分的测定条件与本实验差别较大，拟另文发表。

3.2 检测波长、流动相选择 本实验将各对照品溶液在200～400 nm 波长处进行紫外全波长扫描，发现黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素最大吸收波长均在274 nm 附近，故测定黄芩中这4种黄酮类成分时选择其作为检测波长；栀子苷、甘草苷、异甘草苷、甘草酸最大吸收波长分别为237、276、360、252 nm，若用同一波长检测将会降低某些成分灵敏度，参考2015年版 《中国药典》，选择237 nm 作为栀子苷、甘草苷、甘草酸检测波长，360 nm 作为异甘草苷检测波长。

测定4种黄酮类成分时，分别考察了水-甲醇、0.2% 磷酸-甲醇、水-乙腈、0.2% 磷酸-乙腈，发现以0.2%磷酸-甲醇为流动相梯度洗脱时，可达到较好的峰形和分离效果。然后，分别考察0.05% 磷酸-乙腈、0.05% 磷酸-甲醇、0.05% 三氟乙酸-乙腈、0.05%三氟乙酸-甲醇，最终确定0.05%磷酸-乙腈作为测定栀子苷、甘草苷、异甘草苷、甘草酸的流动相。

3.3 样品处理方法选择 本实验分别考察了甲醇超声提取、70% 乙醇超声提取、70% 乙醇加热回流，发现黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草苷、异甘草苷、甘草酸采用70% 乙醇提取效果较好，并且超声、加热回流提取效果无明显差异，考虑到操作方便，最终确定70% 乙醇超声提取作为样品处理方法。