红树植物异色拟盘多毛孢内生真菌次级代谢产物及其生物活性

李晓芳，田颖超，董 乾，耿文跃，宋小妹，罗都强∗

（1.河北大学生命科学学院，河北 保定 071002；2.河北大学化学与环境科学学院，河北 保定 071002）

异色拟盘多毛孢Pestalotiopsis versicolor是红树植物的内生真菌［1］。红树植物生长在海洋和陆地之间，为适应高盐、潮汐环境，其可能含有结构新颖、活性独特的化学物质。这类植物体内的内生真菌，也具有独特的物种分布和代谢途径，代谢产物也有着较强的多样性。近年来，从红树植物内生真菌中分离得到一批骨架新颖的化合物，活性包括抗菌、抗肿瘤、抗氧化等［2-5］。但业内对异色拟盘多毛孢的相关研究还在起步阶段，因此本研究对其固体发酵产物进行分离，鉴定其次生代谢产物的结构并测定化合物的生物活性。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Bruker AM-600 型核磁共振仪、APEX-ulltra 7.0T 型质谱仪（德国 Bruker 公司）；Shimadzu UV-210 型红外光谱仪（日本Shimadzu 公司）；Perkin-Elmer 577 型紫外光谱仪（美国Perkin-Elmer 公司）；BSZ-100 型自动部分收集仪（上海青浦沪西仪器厂）；DHP-9082 型电热恒温培养箱（上海飞越仪器有限公司）；ZHWY 型双层恒温摇床（上海智城分析仪器有限公司）；R-210 型旋转蒸发仪（瑞士 Buchi 公司）；DLSB-5／20 型低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司）；ZF7 三用紫外分析仪（巩义市予华仪器有限责任公司）；UV-210 型紫外可见分光光度计（杭州陆恒生物科技有限公司）。电热蒸汽压力消毒器（上海三申医疗器械有限公司）；ZHJH-C112C 型超净工作台（上海智城分析仪器有限公司）；BSA224S 型电子天平（德国 Sartorius 公司）；FLUOstar OPTIMA 型酶联免疫检测仪（德国BMG Labtech 公司）；DHP-9082 型电热恒温培养箱（上海飞越实验仪器有限公司）。96 孔板（美国Costar 公司）；GF254型薄层层析硅胶（30 mm×100 mm）、薄层层析硅胶板（200 mm×200 mm）购自青岛海洋化工厂分厂；柱层析硅胶（200～300 目，烟台江友硅胶开发有限公司）；拌样硅胶（60～80 目，青岛永海硅胶有限公司）；MCI GEL CHP 20SS 购自日本三菱公司；ODSC18（德国 Merck 公司）。HPLC、NMR、MS 和红外、紫外分析试剂是色谱纯；其他试剂均为分析纯。DMSO、磷酸缓冲液、PNPG（4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷）、阿卡波糖、Na2CO3等购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 材料

1.2.1 菌株 本研究的异色拟盘多毛孢菌株由浙江大学张敬泽教授提供并鉴定为正品，本实验室保藏。

1.2.2 培养基 改良 PD 培养基为去皮马铃薯200.0 g，加入 1 000.0 mL 无菌水煮沸并过滤。加入葡萄糖20.0 g，经高压灭菌锅121 ℃、湿热灭菌20.0 min，再加入琼脂粉20.0 g。大米培养基为大米 80.0 g，加入 100.0 mL 无菌水，密闭封口浸泡12 h，经高压灭菌锅 121 ℃、湿热灭菌 20.0 min。

2 提取与分离

将活化后的菌种转接到cPDA 液体培养基中；然后将其放于摇床上，28 ℃，150 r／min 的条件下恒温培养7 d，制成3 L种子液；最后将种子液以10%的接种量接种到准备好的大米固体培养基中，28 ℃条件下在恒温箱中发酵33 d。

在固体发酵产物中加入等体积的乙酸乙酯，搅拌均匀。浸泡萃取后，得到萃取液。然后用旋转蒸发仪将萃取液进行蒸馏浓缩得到部分浸膏。将上述过程重复3～4 次，共得到浸膏60 g。

将浸膏与柱层析硅胶（60～80 目）以 1 ∶1.5的比例混合拌样得到粗样。用硅胶柱层析（200～300 目）方法进行分离。粗分，用石油醚 ∶乙酸乙酯（19 ∶1、9 ∶1、6 ∶1、4 ∶1、2 ∶1、1 ∶1）进行梯度洗脱，得到6 个组分（Fr.1-6）。再将所得6个组分反复硅胶柱层析分离，结合制备薄层层析、Sephadex LH-20 得到单体化合物［6］。这 6 个部分再分别用硅胶柱分离，用石油醚 ∶乙酸乙酯（19 ∶1、9 ∶1、6 ∶1、4 ∶1、2 ∶1、1 ∶1）梯度洗脱，得到6 个部分。

再将得到的6 个部分上硅胶柱，如此重复2～3次，然后用凝胶及重结晶的方法反复纯化。Fr.4部分得到化合物 4（20 mg）、5（20 mg）、6（20 mg）；Fr.3 部分得到化合物 1（12 mg）、2（14 mg）；Fr.2 部分得到化合物 3（14 mg）、7（20 mg）、8（8 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：无色晶体（甲醇），含有量 94%，LRESIMSm／z：181.08［M ＋ H］＋（计算值181.09），推测分子式 C10H12O3。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：1.94（3H，s，H-10），2.76（2H，t，J=7.2 Hz，H-5），4.15（2H，t，J=7.2 Hz，H-3），6.7（1H，d，J=8.52 Hz，H-5），6.7（1H，d，J= 8.52 Hz，H-9），7.01（1H，d，J=8.52 Hz，H-8），7.01（1H，d，J= 8.52 Hz，H-6）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：175.7（C-1），159.5（C-4），133.6（C-6），132.6（C-7），119.0（C-5），134.8（C-8），119.0（C-9），69.3（C-3），37.8（C-2），23.7（C-10）。以上数据与文献［7］一致，故鉴定为3-（4-甲苯氧基）丙酸。

化合物2：白色晶体（甲醇），含有量 95%，LRESIMSm／z：139.07［M ＋ H］＋（计算值139.07），推测分子式 C8H10O2。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.05（2H，d），6.72（2H，d），3.74（2H，t），2.73（2H，t）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：129.5（C-1），129.5（C-2），114.7（C-3），155.3（C-4），114.7（C-5），129.5（C-6），63.1（C-7），38.0（C-8）。以上数据与文献［8］一致，故鉴定为对羟基苯乙醇。

化合物3：无色粘稠液体（甲醇），含有量93% ，LRESIMSm／z：123.07［M ＋H］＋（计算值123.08），推测分子式 C8H10O。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.71（2H，d，J= 8.4 Hz，H-2，6），7.02（2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5），2.71（2H，t，J=7.2 Hz，H-7），3.68（2H，t，J= 7.2 Hz，H-8）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：156.8（s，C-1），116.2（d，C-2，6），130.9（d，C-3，5），131.1（s，C-4），39.4（t，C-7），64.6（t，C-8）。以上数据与文献［9］一致，故鉴定为2-苯乙醇。

化合物4：白色结晶（甲醇），含有量 95%，HRESIMSm／z：431.311 5［M ＋ H］＋（计算值431.311 7），推测分子式 C28H44O4。1H-NMR（CD3OD，600 MHz）δ：5.65（1H，s，H-7），5.24（1H，dd，J=15.3，6.9 Hz，H-23），5.16（1H，dd，J= 15.3，6.6 Hz，H-22），4.04（1H，m，H-3），1.02（3H，d，J=6.6 Hz，H-21），0.98（3H，s，H-19），0.92（3H，d，J=6.9 Hz，H-28），0.84（3H，d，J=6.6 Hz，H-27），0.82（3H，d，J=6.6 Hz，H-26），0.61（3H，s，H-18）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：26.1（C-1），30.8（C-2），67.6（C-3），37.0（C-4），79.2（C-5），197.3（C-6），119.1（C-7），164.7（C-8），76.2（C-9），42.7（C-10），28.7（C-11），34.9（C-12），45.1（C-13），51.7（C-14），22.2（C-15），27.6（C-16），55.8（C-17），12.1（C-18），20.2（C-19），40.0（C-20），21.1（C-21），135.1（C-22），132.3（C-23），45.3（C-24），32.9（C-25），19.5（C-26），20.0（C-27），17.5（C-28）。以上数据与文献［10］一致，故鉴定为 3β，5α，9α-三羟基-（22E，24R）-麦角甾-7，22-二烯-6-酮。

化合物5：无色针晶（氯仿），含有量 93%，HRESIMSm／z：392.342 2［M ＋ H］＋（计算值392.342 6），推测分子式 C28H44O。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：0.62（3H，s，H-18），0.83（3H，d，J=7.2 Hz，H-26），0.83（3H，d，J=7.0 Hz，H-27），0.90（3H，d，J=6.8 Hz，H-28），0.94（3H，s，H-19），1.01（3H，d，J=6.5 Hz，H-21），3.63（1H，m，H-3），5.13（2H，m，H-22，23），5.32（1H，m，H-7），5.33（1H，m，H-6）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：38.4（C-1），32.1（C-2），70.4（C-3），40.2（C-4），139.8（C-5），119.8（C-6），116.2（C-7），141.4（C-8），46.2（C-9），37.3（C-10），21.2（C-11），39.2（C-12），42.9（C-13），54.2（C-14），23.7（C-15），28.1（C-16），56.0（C-17），12.0（C-18），16.2（C-19），40.5（C-20），21.3（C-21），42.8（C-24），33.2（C-25），20.1（C-26），19.6（C-27），17.5（C-28）。以上数据与文献［11］一致，故鉴定为麦角甾醇。

化合物6：浅黄色晶体（氯仿），含有量94%，HRESIMSm／z：392.311 1［M ＋ H］＋（计算值392.311 3），推测分子式 C28H40O。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：6.62（1H，d，J=9.5 Hz，H-7），6.06（1H，d，J=9.5 Hz，H-6），5.70（1H，s，H-4），5.19（2H，m，H-22，H-23），1.26～2.59（18H，m），1.20（3H，d，J= 6.7 Hz，H-21），1.05（3H，s，H-19），0.97（3H，s，H-18），0.95（3H，d，J=6.9 Hz，H-28），0.86（3H，d，J=6.7 Hz，H-27），0.83（3H，d，J=6.7 Hz，H-26）；13CNMR（150 MHz，CDCl3）δ：199.5（C-3），164.3（C-8），154.0（C-16），133.3（C-22），134.1（C-7），132.2（C-23），124.7（C-5），123.5（C-6），122.9（C-4），56.6（C-17），45.4（C-9），44.8（C-13），43.8（C-10），39.7（C-20），36.8（C-10），35.4（C-12），34.4（C-1），33.8（C-2），33.3（C-25），27.5（C-16），26.3（C-15），23.5（C-21），21.4（C-26），19.6（C-27），19.1（C-18），18.7（C-11），17.2（C-28），16.6（C-19）。以上数据与文献［12］一致，故鉴定为麦角甾4，6，8（14），22-四烯-3 酮。

化合物7：无色针状结晶（氯仿），含有量98% ，HRESIMSm／z：320.120 0［M＋H］＋（计算值320.120 5），HRESIMS［M＋NH4］＋m／z：336.157 8，分子量318，且推测它可能含有氯元素。由单晶结构可确定其立体结构，根据键长可知其含有1 个氯原子。因此推测分子式为 C15H23O5Cl。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：0.94（3H，s，H-15），1.30（3H，s，H-11），1.46（3H，s，H-14），1.69（1H，dd，J=3.78，3.72 Hz，H-6a），1.75（3H，s，H-13），2.25（1H，t，J=2.34 Hz，H-2a），2.34（1H，dd，J=3.42，3.42 Hz，H-2b），3.10（1H，s，H-4），3.22（1H，d，J=3.24 Hz，H-6b），3.28（1H，d，J=2.46 Hz，H-1），4.09（1H，d，J=3.24 Hz，H-8），4.21（1H，m，H-7）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：20.5（C-13），23.7（C-14），24.6（C-15），29.8（C-11），37.7（C-5），40.4（C-2），42.1（C-9），41.8（C-6），55.3（C-1），61.1（C-4），70.2（C-3），68.3（C-10），72.3（C-7），72.7（C-8），175.6（C-12）。而通过碳谱、氢谱数据可确定，含有 5 个季碳、4 个叔碳、2 个仲碳、4 个伯碳，共 15 个 碳，其中1个为羧基碳。经1H-1HCOSY 中可以看出2 和6 位的氢裂分了，并且 1-H 与 2-H 相关，11-H 与 C-3 相关，7-H 与6-H、8-H 相关，见图1。从 HMBC 谱图中可以看出 4-H 与 C-12、C-3、C-5 相关，C-5 与 4-H、13-H、6-H、7-H 相关，C-9 与 7-H、8-H、14-H、15-H 相关。C-10 与 1-H、14-H、15-H 相关，C-3 与 1-H、2-H、4-H、11-H 相关。而且化合物 7 的结构与文献［13］一致，故鉴定为（1aS，3R，4R，4aR，6S，7R，8aS）-7-chloro-3，6-dihydroxy-3，4a，8，8-tetramethyl-octahydro- 1aH-naphtho［1-b］oxirene-4-carboxylic acid。

图1 化合物7 的主要H-H COSY 和HMBC 相关Fig.1 Key H-H COSY and HMBC correlations of compound 7

化合物 8：无色油状（甲醇），含有量 93%，HRESIMSm／z：217.103 0［M ＋ H］＋（计算值217.103 1），推测分子式 C10H16O5。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：5.05（1H，m，H-9），4.15（1H，m，H-3），3.35（1H，m，H-4），2.36（1H，dd，J=17.8，6.3 Hz，H-5a），2.29（1H，dd，J=14.5，3.1 Hz，H-2a），2.63（1H，dd，J=14.5，2.0 Hz，H-2b），2.35（2H，m，H-7），2.34（1H，dd，J=17.8，6.3 Hz，H-5b），2.05（2H，m，H-8），1.27（3H，d，J=6.30 Hz，H-10）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：169.6（C-1），39.5（C-2），68.6（C-3），72.2（C-4），44.4（C-5），212.5（C-6），39.5（C-7），32.6（C-8），73.2（C-9），18.2（C-10）。以上数据与文献［14］一致，故鉴定为cepharosporolides G。

4 活性测试

以PNPG 法测定化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制能力。405 nm 测 OD 值，每孔重复做 3 次，以阿卡波糖作为阳性对照。实验设4 个组分别为 Ac（空白组）、Acb（空白对照组）、As（样品测定组）、Asb（样品对照组）。抑制率计算公式为抑制率% =1-（Ac-Acb）／（As-Asb）。

本实验检测到乙酸乙酯粗提物对α-葡萄糖苷酶有中等抑制能力，因此检测各化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制率。见表1。

表1 各化合物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率Tab.1 Inhibition rates of α-glucosidase activity of various compounds

化合物 1 在质量浓度 6.25 mg／mL 时对 α-葡萄糖苷酶具有较弱的抑制活性，抑制率5.14%。

5 讨论

本研究对异色拟盘多毛孢内生真菌的固体发酵产物进行分离，得到8 个化合物。其中，含氯化合物7 是首次从拟盘多毛孢属内生真菌的固体发酵产物中分离得到，大环内酯类化合物5 是首次从异色拟盘多毛孢内生真菌的固体发酵产物中分离得到。红树林植物及其内生细菌、内生真菌中也有分离到大环内酯类化合物［15-17］。化合物 1 质量浓度为6.25 mg／mL 时对α-葡萄糖苷酶具有较弱的抑制活性，可以试图进行结构修饰，开发为降糖药物。本实验证明了红树林植物及其拟盘多毛孢属内生真菌具有良好的开发潜质，并为其次生代谢产物的深层研究提供理论依据。