杜仲中五环三萜类及其抗肿瘤活性

钱文丹，谭艾娟∗，吕世明，陈波利，杜安定，王胜优

（1.贵州大学生命科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

天然抗肿瘤药物作为抗肿瘤药物中的1 个重要分支，必在基础研究及临床应用中具有重要的地位。据文献报道，大多数五环三萜类化合物具有抗肿瘤、抗炎、抗 HIV 等药理作用。桦木酸是 1种羽扇豆烷型的五环三萜，分布于桦木属及其他许多属植物中，是植物的次生代谢产物［1］。在研究中发现，桦木酸本身毒性较低，对正常细胞中的外周血淋巴细胞和皮肤成纤维细胞没有毒性［2］，其对肿瘤细胞的抑制作用是通过诱导细胞的程序性死亡完成的［3］。课题组从中分离得到3 个化合物，化合物3 之前只在合成产物中所出现过，首次从杜仲中分离得到。选用HeLa 细胞为材料，与化合物1～2比较，着重对化合物3 的抗肿瘤活性机制进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 AVANCE Ⅲ 500 MHz NMR 超导核磁共振波谱仪（德国Brucker 公司）；UPLC-IT-TOF液相-离子阱飞行时间色谱质谱联用仪（日本岛津公司）；Cellomics ArrayScan VTI HCS 高内涵分析仪（美国 Thermo Scientific 公司）；FV1000 激光扫描共聚焦生物显微镜（日本奥林巴斯公司）；Lecia DM55008 荧光显微镜（德国 Lecia 公司）；Bio-Rad 680 酶标仪（美国伯乐公司）；ECLIPSE Ts2R 倒置荧光显微镜（日本尼康公司）；Agilent 5973 N GCMS LC-MS／MS（美国 Agilent 公司）；CO2细胞恒温培养箱（美国 Thermo Scientific 公司）；XK96-Ⅰ微量振荡器（上海化科实验器材有限公司）；Milli-Q Advantage A10 超纯水机（德国默克密理博公司）。超净工作台（美国 Thermo 公司）；MLS-3750 型高压蒸汽灭菌锅（日本Sanyo 公司）。

1.1.2 细胞与试剂 Hela 细胞株来源于中国科学院西南多样性实验室、MDA-MB-231、T47D 细胞株来源于贵州大学生命科学学院。杜仲购于云南省药材市场。DMEM 培养液、Trypsin EDTA Solution A、FBS、Pen-Strep Solution 购自以色列 Biological Industries 公司；四甲基偶氮唑盐（MTT，美国Amresco 公司）；Hoechst 33258、PI、DCFH-DA 试剂盒（美国 Sigma 公司）；Lysotracker Red DND 99、Mito-tracker Red CMXRos（美国 Invitrogen 公司）；正向层析硅胶（80～100 目，300～400 目），及制备型薄层层析硅胶GF254均为青岛海洋化工生产；所用MCI gel CHP 20P 为日本三菱化工产品；凝胶色谱为 Sephadex LH-20（美国 GE Healthcare Bio-Xciences AB）；用5% H2SO4乙醇溶液作为常规显色试剂等。

1.2 方法

1.2.1 提取与分离 选取杜仲的二氯甲烷层经100～200 目硅胶干法装柱进行划段，分为10 个组分，并将第 2 个组分利用 Sephadex LH-20 洗脱，最后利用 300～400 目硅胶由纯氯仿，氯仿 ∶丙酮（50 ∶1、30 ∶1、20 ∶1、15 ∶1、10 ∶1、3 ∶1）梯度洗脱得化合物1、3 的纯品，以及化合物2 的粗提物，将化合物2 经HPLC 分离，得到化合物2的纯品。

1.2.2 MTT 法测定细胞毒活性 分别取对数生长期的 Hela 细胞、MDA-MB-231 细胞、T47D 细胞，胰酶消化后用细胞计数仪计数，并用含10% 胎牛血清的培养液配成细胞悬液，以每孔6 000～10 000个细胞分别接种到96 孔细胞培养板，每孔加入100 L 细胞悬液，设置 4 个重复，放置于 37 ℃细胞培养箱过夜培养。待细胞贴壁，加入待测化合物的DMSO 溶液（初筛浓度 40 μmol／L），将有抑制细胞活力的化合物设5 个浓度梯度进行复筛，每种浓度处理均设4 个复孔作为重复对照，顺铂做为阳性药物，并设置阳性、阴性和空白对照组，培养48 h后，除空白对照组每孔加 MTT（5 mg／mL）溶液100 L，继续孵育 4 h，每孔加 100 L 的 DMSO 溶液，振荡 5～15 min。选择以 570 nm 为波长，酶联免疫检测仪读取各孔光吸收值，利用公式计算化合物对肿瘤细胞活力的抑制［4］。活细胞率=（细胞总数-死细胞数）／细胞总数×100%。采用 GraphPad Prism 5.0 软件计算化合物对肿瘤细胞的IC50值。

1.2.3 PI，Hoechst 染色测定细胞凋亡 取对数生长期的Hela 细胞计数并配成细胞悬液，选取12 孔细胞培养板，每孔放入盖玻片，将Hela 细胞接种于盖玻片上（为了在正置荧光显微镜下拍照方便），待细胞长到20%，加不同浓度的化合物处理48 h 后用 PBS 洗涤细胞并用 4% 多聚甲醛固定20 min，用 PBS 洗涤之后加Hoechst 33342（10 μg／mL）和 PI（10 μg／mL）放于细胞培养箱染色30 min，并放于正置荧光显微镜下，选红色和蓝色通道的荧光进行拍摄分析。

1.2.4 细胞内源ROS 测定 待培养皿细胞长到对数生长期，用胰酶消化，细胞计数器计数细胞。并将细胞接种于准备好的12 孔细胞培养板中，37 ℃细胞培养箱中放置过夜待细胞贴壁，加入化合物处理24 h（提前1 h 加入阳性对照ROS 活性氧供氢体），每孔加入 DCFH-DA 探针后放于培养箱25～30 min，正置荧光显微镜下拍照。

1.2.5 Mito-tracker 染料测定细胞线粒体形态 用激光共聚焦小皿铺HeLa 细胞，药物处理24 h 后，以 Mito-tracker 荧光探针按5 000 ∶1 的浓度稀释并对细胞着色，染完线粒体时需换新鲜培养基让细胞反吐30 min，并用4%甲醛固定15 min，随后将甲醛吸掉，加入PBS，最后用激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体形态的变化［5］。

1.2.6 lysotracker 筛选化合物抑制溶酶体酸化和诱导溶酶体生成 在96 孔细胞培养板中加入对数生长期的HeLa 细胞悬液每孔100 μL，待细胞长到80%左右，且在细胞状态良好的情况下，加入溶解于 DMSO 的化合物至终浓度为 40 μmol／L，放置37 ℃细胞培养箱孵育3～4 h，随后加入Lysotracker Red DND 99 继续孵育30 min 后利用高内涵药物筛选仪测定细胞内红色荧光强度，并将有效果的化合物进行复筛［6］。将HeLa 细胞悬液计数并加入激光共聚焦小皿，每个小皿加2 mL 细胞悬液，待细胞密度至 70%～80%，加药处理 3～4 h 后，染色30 min。去除含有 Lysotracker Red DND 99 的培养液，添加新的培养液，并在倒置荧光显微镜下，以488 nm为波长进行拍照，从而观测荧光强度是否增强或减弱［7］。

1.2.7 数据分析 原始数据使用GraphPad Prism 5.0 生成柱状图，计算IC50值。所有数据均以（）表示，采用 SPSS 17.0 统计学软件，组间比较采用单因素方差分析及配对t检验，P＜0.05 差异显著。

2 结果

2.1 结构鉴定

化合物1：核磁共振的13C-NMR 和 DEPT显示该化合物有30 个碳信号，分别为6 个甲基，11 个亚甲基，6 个次甲基和 7 个季碳。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：4.95（1H，brs，Hβ-29），4.77（1H，brs，Hα-29），3.50（1H，dd，J=15.9，7.4 Hz，H-3），2.25（1H，m，H-19），1.79，0.99，0.97，0.96，0.88，0.85（Me-30，Me-27，Me-23，Me-26，Me-25，Me-24），0.67（1H，d，J=8.7 Hz，H-5）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：C：39.5（C-1），28.7（C-2），78.1（C-3），39.3（C-4），55.9（C-5），18.8（C-6），34.8（C-7），41.1（C-8），51.0（C-9），37.5（C-10），21.2（C-11），26.1（C-12），38.6（C-13），42.9（C-14），31.2（C-15），32.9（C-16），56.7（C-17），47.8（C-18），49.8（C-19），151.4（C-20），30.3（C-21），37.5（C-22），28.3（C-23），14.9（C-24），16.4（C-25），16.4（C-26），14.9（C-27），178.9（C-28），110.0（C-29），19.5（C-30）。以上数据与文献［8］基本一致，故鉴定为桦木酸。

化合物2：核磁共振的13C-NMR 和 DEPT显示该化合物有30 个碳信号，分别为7 个甲基，11 个亚甲基，6 个次甲基和 6 个季碳。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：4.88（1H，brs，Hβ-29），4.74（1H，brs，Hα-29），3.34（1H，m，H-3），2.15（1H，m，H-19），1.77（3H，s，Me-30），1.03，0.99，0.97，0.85，0.80，0.79（Me-26，Me-27，Me-23，Me-25，Me-28，Me-24），0.69（1H，d，J=10.0 Hz，H-5）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：C：37.6（C-1），27.6（C-2），78.2（C-3），39.6（C-4），55.9（C-5），18.8（C-6）34.7（C-7），41.3（C-8），50.8（C-9），37.4（C-10），19.3（C-11），25.8（C-12），37.5（C-13），43.0（C-14），27.6（C-15），34.9（C-16），43.0（C-17），48.4（C-18），48.6（C-19），150.1（C-20），30.1（C-21），39.6（C-22），28.3（C-23），16.2（C-24），16.4（C-25），16.5（C-26），15.0（C-27），18.8（C-28），110.0（C-29），19.3（C-30）。以上数据与文献［8］基本一致，故鉴定为羽扇豆醇。

化合物3：核磁共振的13C-NMR 和 DEPT显示该化合物有41 个碳信号，分别为7 个甲基，20 个亚甲基，6 个次甲基和 8 个季碳。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：0.84（3H，m，H-11′），0.87（3H，Me-24），0.96（3H，Me-23），1.22（9H，Me-25，Me-26，Me-27），1.27（6H，H-5′，H-6′，H-7′），1.34（6H，H-4′，H-8′，H-9′），1.37（2H，H-10′），1.42（1H，m，H-5），1.64（2H，H-3′），2.21（1H，m，H-19），2.35（2H，H-2′），4.41（1H，dd，J=12.4 Hz，H-3），4.58（1H，brs，Hα-29），4.72（1H，brs，Hβ-29）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：14.3（C-11′），14.9（C-27），16.4（C-24），16.4（C-25），18.8（C-26），18.2（C-6），19.5（C-30），21.2（C-11），22.7（C-10′），24.7（C-12），25.4（C-8′），25.7（C-2），28.7（C-23），29.0（C-4′），29.3（C-5′），29.6（C-6′），29.6（C-7′），30.3（C-21），29.9（C-15），25.0（C-3′），31.9（C-9′），32.0（C-16），34.2（C-2′），35.2（C-7），37.1（C-22），37.5（C-10），37.7（C-4），38.6（C-13），38.6（C-1），40.7（C-8），42.5（C-14），49.3（C-18），48.0（C-19），50.6（C-9），55.5（C-5），56.8（C-17），80.9（C-3），110（C-29），150.3（C-20），173.1（C-1′），181.2（C-28）。以上数据与文献［9］基本一致，故鉴定为3-O-laurylbetulinic acid。

2.2 MTT 法测定细胞活力 将化合物 1、3 对HeLa 细胞按不同浓度（3.75～60 μmol／L）处理72 h，化合物 2 对 HeLa 细胞按不同浓度（5～80 μmol／L）处理 48 h，见图1，表明随着加药浓度的增加，细胞活力逐渐降低。每一组加药处理组与阴性对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。化合物 1、3 浓度为 60 μmol／L 时，对 Hela 细胞增殖抑制率分别为 75%、80%；化合物 2 浓度为80 μmol／L 时，抑制率达 86% ，表明化合物 1～3对Hela 细胞有细胞毒活性，且与加药浓度呈正相关。将化合物 1～3 对 MDA-MB-231、化合物 3 对T47D 细胞按 5～80 μmol／L 的浓度梯度处理 48 h，发现细胞活力按梯度不断下降，表明化合物1～3对这2 株乳腺癌细胞均有细胞毒活性。由柱状图可以看出当这3 个化合物浓度降低至很低时，仍对肿瘤细胞的细胞活力起抑制作用。然而随着浓度的增高，药效的增幅却不十分明显。化合物1～3 对3株肿瘤细胞的IC50见表1。

图1 各化合物对Hela、MDA-MB-231、T47D 细胞活力的影响Fig.1 Effects of various compounds on the cell viability of Hela，MDA-MB-231 and T47D cells

表1 抗肿瘤实验 IC50值（μmol·L-1）Tab.1 IC50 values in antitumor tests（μmol·L-1）

2.3 PI 和 Hoechst 染色 将化合物 1、3 以 30、60 μmol／L的浓度，化合物 2 以 40、80 μmol／L 的浓度处理 HeLa 细胞 48 h，并用 Hoechst 染色。发现随着时间延长，细胞数量明显减少，且淡蓝色细胞减少，亮蓝色细胞增多；并且细胞形态发生了明显的畸形变化，一些细胞核呈月牙型且边集化，表明细胞正在启动凋亡。用PI 染色后，发现随着浓度加大和时间延长，红色荧光逐渐增强，表明细胞膜破损的死细胞增加。当化合物1、3 的浓度达到30 μmol／L 时，细胞就开始出现明显凋亡的现象。化合物 2 在浓度达到 80 μmol／L 时，同样出现了明显的凋亡迹象。表明这3 个化合物都能诱导Hela细胞发生凋亡。见图2。

2.4 DCFH-DA 探针测定 Hela 细胞中 ROS 的生成 由于ROS 的产生是细胞凋亡的早期事件，因此在化合物3 处理24 h 后测定细胞中的ROS。见图3，随着化合物3 浓度的增加，绿色荧光增强。与阴性对照组相比，H2O2组及 40 μmol／L 的化合物3 诱导明亮的绿色荧光，表明有大量的ROS 产生，而对照组的ROS 处于基础水平。结果表明，由于ROS 的过量生成，化合物3 诱导Hela 细胞中线粒体介导的细胞凋亡。

2.5 lysotracker 和Mito-tracker 染料测定溶酶体和线粒体形态 将 HeLa 细胞以 40 μmol／L 的化合物1～3 处理 4 h 后，用 Lysotracker Red DND 99 染料染色0.5 h，并用高内涵药物筛选仪分析并计算出细胞密度以及荧光强度。化合物1～2 处理组与对照组相比差异显著（P＜0.05），化合物3 处理组与对照组相比差异极显著（P＜0.01），通过平均荧光强度的比较，初步判断，这3 个化合物能抑制溶酶体的酸化，且化合物3 的抑制效果相对较明显。初步筛选完后，利用激光共聚焦扫描显微镜或倒置荧光显微镜具体观察，可发现，加药组的荧光强度相比对照组明显降低。由此可判断这类化合物能抑制溶酶体的生成，且化合物3 的抑制效果相对化合物1～2 更明显，原因可能是化合物3 相比化合物1～2，空间位阻要更大一些。见图4。

图2 各化合物对HeLa 细胞凋亡的影响Fig.2 Effects of various compounds on apoptosis of HeLa cells

图3 荧光探针DCF-DA 评估Hela 细胞中ROS 产生Fig.3 Evaluation of ROS generation in Hela cells by the fluorescent probe DCF-DA

图4 Lysotracker 着色后平均荧光强度Fig.4 Average fluorescence intensity of cells stained with Lysotracker

将 HeLa 细胞以 40 μmol／L 化合物 1～3 处理24 h后，用 Mito-tracker Red 染料染色。可发现加药处理后的细胞与正常细胞相比，正常细胞线粒体呈丝状或者絮状，而化合物处理组线粒体呈颗粒状，其中化合物2～3 较为明显，由此可推断这一类化合物能诱导线粒体形态发生变化。见图5。

3 讨论

图5 Mito-tracker 探针对HeLa 细胞线粒体的荧光标记Fig.5 Fluorescent labeling of mitochondria in HeLa cells by Mito-tracker probe

天然小分子化合物促进肿瘤细胞凋亡是抗肿瘤药物发展的前期基础研究［10］。近年来，随着对肿瘤生物学、药理学研究的深入，天然抗肿瘤药物逐渐引起了医学界的广泛关注。据文献报道，细胞凋亡的方式主要包括线粒体依赖的凋亡、内质网胁迫诱导凋亡、DNA 损伤及细胞信号转导引起的凋亡［11］。最新的研究也表明恶性肿瘤的发生、发展以及稳态调控与细胞自噬及溶酶体的调控和功能密切相关［12］，这也是未来研究肿瘤治疗的热点和新方向。溶酶体是细胞内负责降解底物的细胞器，也是信号传导的重要枢纽［13］。溶酶体功能的缺失会导致诸如溶酶体贮积症（LSD）和帕金森病等重大疾病［14］。在动物细胞中，溶酶体被认为是内吞途径的终端消化细胞器，富含大量的酸性水解酶，溶酶体膜蛋白多为糖蛋白，其膜内表面带负电荷，这对防止细胞自身被消化有重要的意义［15］。

目前靶向治疗药物阿法替尼等在临床上应用广泛［16］，具有特异性强、疗效显著、对正常组织损伤小等优势，但是长期使用会产生明显的毒副作用和耐药性，因而人们迫切需要开发机制新颖、作用更强、安全性更高的抗肿瘤药。据报道，桦木酸类化合物诱导凋亡的作用机制很多，可能直接作用于线粒体而触发凋亡。桦木酸在细胞游离系统中，经诱导通透性转变的线粒体，能通过释放可溶性因子等方式介导caspase-8 和caspase-3 的分裂。文献中2，3 -羟基桦木酸在体外能使黑色素瘤细胞阻滞在某一生长期，最终导致细胞凋亡［17］。羽扇豆醇酯能够体外诱导TE-1 细胞凋亡，阻滞细胞周期，其作用机理与下调CyclinD1 和CDK4 的蛋白表达，上调抑癌基因p53 的表达有关。也能有效地抑制人乳腺癌MDA-MB-231 细胞的侵袭和转移，其机制可能是抑制了核转录因子 NF-κB 信号途径［18］。本实验以桦木酸及其类似物为研究对象，寻求具有高强度抑制肿瘤细胞生长及促进肿瘤细胞凋亡的化合物结构类型。

4 结论

本实验从杜仲二氯甲烷提取物中分离得3 个化合物，并对其抗肿瘤活性进行研究。发现均有良好的抗肿瘤活性，经 MTT 法测定其对 HeLa、MDAMB-231、T47D 细胞的细胞活力抑制。又将这 3 个化合物分别进行PI 和Hoechst 染色，发现化合物1、3 达到 30 μmol／L 时，均能有效地诱导肿瘤细胞的凋亡，而化合物2 的活性相对较弱一些。化合物3 能促进细胞内源 ROS 的生成，最后将这3 个化合物分别处理的肿瘤细胞利用Lysotracker Red DND 99 荧光探针染色，这3 个化合物均能抑制溶酶体的生成，其中化合物3 的抑制效果相对较明显。用Mito-tracker Red 荧光探针标记线粒体，发现这些化合物能促使线粒体形态破碎。通过体外细胞实验，推断这类化合物的抗肿瘤作用可能是溶酶体和线粒体依赖的相关途径。