HPLC法同时测定款冬花中7种成分

吴 笛，雷 昌，唐 林

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，湖南 长沙 410208）

款冬花为菊科植物款冬Tussilago farfaraL.的干燥花蕾，具润肺下气、止咳化痰之功效，为常用中药材，临床多用其蜜炙品（蜜款冬花）。课题组前期已对其化学成分进行了系统的植化分离，从中分离得到款冬酮［1］及多种黄酮类、咖啡酰基奎宁酸类化合物［2］。临床上，细菌、病毒感染呼吸道引起的炎症如气管炎、咽喉炎、肺炎等是导致咳嗽的主要原因之一。黄酮类、咖啡酰基奎宁酸类化合物具有抗菌、抗炎作用［3-8］，可能与款冬花镇咳功效相关。有文献［9］证实从款冬花中分离得到的绿原酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸（异绿原酸A）、3，4-二咖啡酰基奎宁酸（异绿原酸B）、4，5-二咖啡酰基奎宁酸（异绿原酸C）均具有显著的镇咳、祛痰、抗炎作用。

2015年版 《中国药典》 一部款冬花项下的含有量测定仅检测款冬酮1种成分，不能全面反映款冬花的质量。文献［10］采用 HPLC 法同时测定款冬花中9种成分的含有量，文献［11］采用一测多评技术同时测定款冬花中10种成分的含有量，两者检测的指标成分虽多，但选择的指标成分并不全面，且部分为含有量较低的非主要成分，部分为非药效相关成分，部分为罕见成分（对照品难得，定量分析难以普及）。本研究拟建立HPLC 法同时测定款冬花中绿原酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸 A、异绿原酸 C、款冬酮的含有量，以期为款冬花的质量评价提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），包括 G1311C 四元泵、G1329B 自动进样器、G1330B 自动进样器控温模块、G1316 A柱温箱、G1315D DAD 检测器；ELGA LA612 型超纯水机（英国Elga 公司）；SK7200HP 型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；Mettler Toledo AL204 型分析天平（万分之一，瑞士Mettler Toledo 公司）；Sartorius BP211D 型分析天平（十万分之一，德国 Sartorius 公司）；Mettler Toledo FE-20型酸度计（瑞士Mettler Toledo 公司）。

1.2 材料 款冬花药材采集于国内各主要产区，经湖南中医药大学第一附属医院吴笛博士鉴定均为菊科植物款冬Tussilago farfaraL.的干燥花蕾。蜜款冬花的制备按照2015年版 《中国药典》 一部款冬花项下蜜款冬花的要求及四部规定的蜜炙法进行［12-13］。药材和蜜炙品经 60 ℃干燥后，粉碎成细粉（过3 号筛）。

对照品绿原酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸C、款冬酮均为自制，异绿原酸 A 购于成都普菲德生物技术有限公司，经HPLC 检测，含有量均大于98%；甲醇、乙腈均为色谱纯，购于美国Tedia 公司；磷酸为色谱纯，购于天津市光复精细化工研究所；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 依利特 Hypersil ODS2 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇为流动相 A，乙腈为流动相B，0.1%磷酸溶液为流动相C，梯度洗脱程序见表1；检测波长220 nm；柱温25 ℃；体积流量 1 mL／min；进样量 10 μL。色谱图见图1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 对照品溶液制备 精密称取干燥至恒定质量的绿原酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、款冬酮对照品适量，加甲醇制成每 1 mL 各 含 100、50、10、100、100、100、10 μg 的溶液，即得。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3 供试品溶液制备 取款冬花粉末（过3 号筛）0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇45 mL，超声处理（功率350 W，频率53 kHz）60 min，取出，放冷，用 70% 甲醇补足减失质量，过滤，取续滤液用 0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.4 线性关系考察、最低检测限（LOD）和最低定量限（LOQ）取干燥至恒定质量的绿原酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、款冬酮适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 各含约1 mg 的混合溶液，作为贮备液。取贮备 液，稀 释 至 约 500、100、50、10、5、1、0.5 μg／mL，在 “2.1”项色谱条件下进样。以对照品质量浓度为横坐标（X），相应峰面积为纵坐标（Y）进行回归。逐步稀释对照品溶液，按信噪比3 和10 分别计算各成分的最低检测限（LOD）和最低定量限（LOQ）。结果见表2。

2.5 精密度试验

2.5.1 日内精密度 以对照品溶液连续进样5 次，得绿原酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸 C、款冬酮峰面积的 RSD 分别为0.8% 、0.2% 、0.9% 、0.6% 、0.5% 、0.7% 、0.4%，表明日内精密度良好。

2.5.2 日间精密度 以对照品溶液连续进样5 d，1 次／d，得绿原酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸 B、异绿原酸A、异绿原酸C、款冬酮峰面积的RSD 分别为1.8%、0.9%、1.1%、1.3%、1.6%、1.4%、0.7%，表明日间精密度良好。

表2 各成分线性关系、最低检测限和最低定量限Tab.2 Linear relationships，limit of detection（LOD）and limit of quantity（LOQ）of various constituents

2.6 重复性试验 取同一样品（编号13），见表3，6 份，每份称取 0.3 g，精密称定，按 “2.3”项下的方法平行制备供试品溶液，进样测定，得绿原酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸 B、异绿原酸A、异绿原酸C、款冬酮含有量RSD 分别为2.0%、1.6% 、1.3% 、2.4% 、2.8% 、2.5% 、1.7% ，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取 “2.6”项下同一供试品，于 0、6、12、24、48、72 h 连续进样 6 次，记录72 h 内峰面积，得绿原酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、款冬酮峰面积 RSD 分 别 为 1.2%、0.8%、1.5%、1.7%、1.6% 、1.9% 、0.7% 。

2.8 加样回收率试验 取已知含有量的同一批次样品（编号13）约 0.15 g，精密称定，精密加入高、中、低3 个剂量的绿原酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、款冬酮对照品，共9 份，按 “2.3”项下方法制备供试品溶液，在 “2.1”项色谱条件下进样。测得绿原酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、款冬酮的加样回收率分别为99.5%（RSD 2.1%）、101.1%（RSD 2.5%）、100.8%（RSD 1.8%）、99.3%（RSD 2.0% ）、102.2%（RSD 2.3%）、99.0%（RSD 2.6%）、101.9%（RSD 2.8%）。

2.9 样品含有量测定 取款冬花药材和蜜炙品（蜜炙品的取样量折算成对应的药材的量），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在 “2.1”项色谱条件下进样，计算绿原酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、款冬酮的含有量。结果见表3。

表3 各成分含有量测定结果（n=3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（n=3）

3 讨论

3.1 定量分析指标成分选择 对款冬花不同浓度甲醇提取液分别进行HPLC 分析，显示主要成分为绿原酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、款冬酮。芦丁、异槲皮苷为黄酮类化合物，具抗菌、抗炎活性［3-5］，可能与款冬花镇咳功效相关；绿原酸、异绿原酸 B、异绿原酸A、异绿原酸C 为咖啡酰基奎宁酸类化合物，已被证实具有显著的镇咳、祛痰、抗炎作用［9］；款冬酮为2015年版 《中国药典》 规定的款冬花的质量控制指标成分。综上，选择此7种成分作为款冬花定量分析的指标成分。

3.2 色谱条件优化 款冬酮的最大紫外吸收波长为220 nm，220～250 nm 波段紫外吸收急剧降低，250 nm 以上波段紫外吸收极弱。绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 的紫外吸收相似，芦丁、异槲皮苷的紫外吸收相似，此6种成分在220 nm 处均有较强紫外吸收。综合考虑三类成分的紫外吸收特征，选择220 nm 为检测波长。

对流动相进行了重点考察，咖啡酰基奎宁酸类成分和黄酮类成分在甲醇-水、乙腈-水系统中均出现严重的拖尾现象，故在水相中加入一定量的酸以改善峰形。经比较，甲酸、冰醋酸、磷酸对峰形的改善效果基本一致，但甲酸、冰醋酸在220 nm 波长下均有一定的紫外吸收，用于梯度洗脱时基线向上严重漂移，故选择在水相中加入0.1% 的磷酸（220 nm 波长下无紫外吸收，用于梯度洗脱时基线仅有轻微漂移）。

对于极性较大的咖啡酰基奎宁酸类成分和黄酮类成分，乙腈-0.1%磷酸系统的分离效果较好，而甲醇-0.1%磷酸系统的分离效果较差。与之相反，极性较小的款冬酮在甲醇-0.1%磷酸系统中分离较好，但在乙腈-0.1%磷酸系统中分离较差。在单一的甲醇-0.1% 磷酸系统或乙腈-0.1% 磷酸系统中，三类成分难以同时得到良好的分离。为兼顾各指标成分的分离效果，采用了甲醇-乙腈-0.1% 磷酸混合系统，经不断优化洗脱条件，各指标成分最终得到良好分离。

3.3 样品处理方法优化 考察了不同溶剂及不同提取方法对各指标成分提取效率的影响，结果显示70%甲醇对各指标成分的提取效率最高；超声处理60 min 对各指标成分的提取效率显著优于静置12 h及超声处理15、30、45 min。因咖啡酰基奎宁酸类化合物遇热不稳定，特别是在溶液状态下稳定性较差，故未考察加热回流提取方法。

3.4 咖啡酰基奎宁酸类成分稳定性 绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 属咖啡酰基奎宁酸类化合物，这是一类由奎宁酸与数目不等的咖啡酸通过酯键连接而成的酚酸类化合物，具有酯键和多酚羟基的结构。酯键结构具有水解性，在碱性条件下易发生水解反应。多酚羟基结构具有还原性，易受空气中的氧、温度和光照的影响，易被氧化。实验显示在室内温度25～35 ℃、不避光及溶液状态下，绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 的稳定性较差，24 h 内相应峰面积即显著变小，但在低温（2～5 ℃）、避光条件下，这些化合物在对照品溶液中至少5 d 内保持稳定，在样品溶液中至少72 h 内保持稳定。

3.5 含有量测定结果 14 批款冬花样品（包括8个药材及6 个蜜炙品）的含有量测定结果显示，不同产地的款冬花药材中各指标成分的含有量差别较大，可能与其不同的生长环境有关；蜜炙品中绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 的含有量较对应的药材有明显降低的趋势，可能与此类成分在蜜炙过程中受热分解、被空气氧化有关；款冬酮的含有量较对应的药材有所升高，具体原因有待深入研究；芦丁、异槲皮苷含有量变化的趋势不明显。