正品、伪品治糜康栓的差异特征元素分析及无机元素特征谱

刘圣金，乔婷婷，马瑜璐，房 方，林瑞超，孙云飞，吴德康∗

（1.南京中医药大学江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏省中药功效物质重点实验室，江苏 南京 210023；2.北京中医药大学，北京 100029；3.江苏省中医院，江苏 南京 210029）

治糜康栓，曾用名治糜灵栓，为通化金马药业集团股份有限公司生产的中药复方栓剂，现收载于2015年版 《中国药典》（一部）［1］。由黄柏、苦参、儿茶、枯矾和冰片5 味中药加工制成的阴道栓，具有清热解毒、燥湿收敛的功效。矿物药枯矾为白矾的炮制品，是治糜康栓的生产原料之一。本课题组前期研究表明［2-3］，目前市场流通的白矾药材有2种，1种为钾明矾即成分主含含水硫酸铝钾［KAl（SO4）2·12H2O］，由硫酸盐类矿物明矾石加工提炼制成；另1种为铵明矾即成分主含含水硫酸铝铵［NH4Al（SO4）2·12H2O］，由化学合成制得，多用于化工，不作为药用。钾明矾为现行版《中国药典》 收载品种，为白矾的正品，铵明矾为枯矾常见的伪品。对市场收集的32 批白矾药材鉴定显示，仅有8 批为钾明矾，合格率25.0%；检测近40 批枯矾样品测定，合格率仅为10.5%。目前国内市场流通白矾药材多为化学合成，仅少数白矾药材是通过矾矿的采矿、选矿、熟化、溶解、纯化、结晶等工艺制得，这种现状给临床用药的安全性、有效性带来了隐患。

本实验通过自制10 批正品治糜康栓（方中枯矾为钾明矾制备）和6 批伪品治糜康栓（方中枯矾为铵明矾制备），以微波消解-ICP-OES／MS 技术测定样品中各无机元素的含有量，研究正品和伪品治糜康栓的差异特征元素及其无机元素特征谱，为其质量控制提供参考。

1 材料

Perkin Elmer 350 D 电感耦合等离子体-质谱仪、Perkin Elmer Optima 8000 电感耦合等离子体-原子发射光谱仪（美国 Perkin Elmer 公司）；Mettler Toledo ME104E 电子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；工业高纯氩气（南京天泽气体有限责任公司）。

Al、K、Fe、Hg、Au 单元素标准溶液，含 As、Ba、Be、Cd、Cr、Cu、Ga、Mn、Ni、Pb、Sb、Sn、Tl、Zn 的多元素标准溶液（100 μg／mL），Ge、In、Tb 的多元素标准溶液（10 μg／mL）（国家有色金属及电子材料分析测试中心）；调谐液为Be、Ce、Fe、In、Li、Mg、Pb、U 的混合标准溶液（1 μg／L，美国 PE 公司）。65% 硝酸（优级纯，德国Merck 公司）；超纯水。10 批正品治糜康栓样品和6 批伪品治糜康栓样品，见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 测定条件［3-6］

2.1.1 ICP-OES 工作参数 RF 功率 1 300 W；雾化气体积流量 0.55 L／min；辅助气体积流量0.2 L／min；冷却气体积流量 12 L／min；样品提升量1.5 mL／min；延迟时间 30 s；重复次数 1；测量方式为标准曲线法。待测元素分析线（nm）分别为 Al 396.153、K 766.490、Fe 238.204。

2.1.2 ICP-MS 工作参数 RF 功率 1 100 W；雾化气体积流量 0.92 L／min；辅助气体积流量1.2 L／min；冷却气体积流量 15 L／min；碰撞气（氦气）体积流量 3 mL／min；采样锥孔径1.1 mm；截取锥孔径0.9 mm；超级截取锥孔径1.0 mm；积分时间1 s；延迟时间40 s；扫描方式为单点跳峰；重复次数3。见表2。

表2 ICP-MS 待测元素质量数、检测模式与内标元素Tab.2 Mass，detection mode and internal standards of ICP-MS determined elements

2.2 标准溶液制备［3，7-9］

2.2.1 Al、K、Fe、Hg 对照品溶液制备 精密量取 Al、K、Fe、Hg 单元素标准液适量，用 3%HNO3溶液稀释制成每1 mL 对照品溶液含Al，K元素量均为 0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、50、100、200 μg，含 Fe 元素 0.05、0.1、0.5、1、5、10 μg，含 Hg 元 素 0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 ng。

2.2.2 含多元素对照品溶液制备 精密量取多元素标准品贮备液适量，用3%HNO3溶液稀释制成每 1 mL 含 As、Ba、Be 3种元素 0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、50、100 ng 的系列质量浓度混合溶液。

2.3 内标溶液制备 精密量取Ge、In、Tb 多元素标准液适量，用3%HNO3溶液配制制成每1 mL 含Ge、In、Tb 10 ng 的混合内标溶液。

2.4 供试品溶液制备 将各治糜康栓样品剪碎，样品取碎块约0.2 g，精密称定，精确加入HNO36 mL，于通风厨中静置 30 min，后于电热板上80 ℃进行预消解，待反应40 min 后，再精确加入H2O22 mL，继续反应至无明显泡沫后，加盖密封，装入微波消解仪中，按预设程序进行消解，程序见表3。消解完成后，待温度降至70 ℃以下，取出消解罐，置于电热板上100 ℃加热挥酸，然后将消解液转移至50 mL 量瓶中，加入200 μL Au 单元素标准溶液（1 μg／mL），用超纯水定容至刻度，摇匀，即为各供试品溶液。除不加Au 单元素标准溶液外，同法制备试剂空白溶液。所得到的样品消解液无色、澄清透明、无固体残渣，表明样品被完全消解。

表3 微波消解程序Tab.3 Digestion programs

2.5 方法学考察［10-14］

2.5.1 线性关系考察 通过预实验，制备对照品溶液。根据待测元素ICP-MS、ICP-OES 测定方法，上机检测18种无机元素不同质量浓度的对照品溶液，ICP-MS 以对照品分析峰响应值与内标元素参比峰响应值的比值为纵坐标（I），ICP-OES 测定纵坐标为对照品分析峰响应值，对照品质量浓度为横坐标（C），进行回归，结果见表4。

2.5.2 检测限 重复测定空白样品溶液10 次，根据IUPAC 规则以3 倍标准偏差所对应的质量浓度作为各元素的方法检出限。由实验结果可知检测限范围为 0.001～2.380 μg／L，能满足待测无机元素分析需求，结果见表4。

2.5.3 精密度试验 取治糜康栓供试品溶液，连续测定6 次，计算各待测元素 RSD 在 0.05～4.34之间，表明该方法精密度良好。

2.5.4 重复性试验 取治糜康栓小块约0.2 g，精密称定，平行6 份，进行测定，计算各待测元素 RSD 在 0.93～6.33 之间，表明该方法精密度良好。

2.5.5 加样回收率试验 取已知元素含有量的治糜康栓样品约0.2 g，精密称定，平行 9 份，分别加入各元素标准溶液适量。按 “2.4”项下方法制备供试品溶液，同法测定，计算各待测元素加样回收率范围均在80%～120%，结果见表5。

表4 各元素线性关系和检测限Tab.4 Linear relationships and detection limits of various elements

表5 各元素加样回收率试验结果（n=9）Tab.5 Results of recovery tests for various elements（n=9）

2.6 样品含有量测定 在上述方法学考察基础上，取供试品溶液依次测定，结果见表6。显示，常量元素正品治糜康栓中K 含有量最高，均值为2.41×104mg／kg，Al、Fe 次之，均值分别为 1.37×104、6.37×10 mg／kg；伪品治糜康栓中 Al 含有量最高，均值为 1.49×104mg／kg，K、Fe 次之，均值分别为3.86×103mg／kg、4.32×102mg／kg。微量元素正品治糜康栓中Mn、Zn、Cr 含有量最高，均值分别为9.738、5.980、1.229 mg／kg，其他微量元素含有量均低于 1.000 mg／kg；伪品治糜康栓中 Mn、Zn、Ga、Cr 的含有量最高，均值分别为 15.477、5.965、2.000、1.432 mg／kg，其他微量元素含有量均低于1.000 mg／kg。2 类样品中重金属及有害元素含有量由高到低均依次为 Cu、As、Pb、Cd、Hg，正品治糜康栓中均值分别为2.497、0.142、0.079、0.002、0.001 mg／kg，伪品治糜康栓中均值分别为2.318、0.250、0.121、0.002、0.001 mg／kg，大部分样品未检出Hg。

2.7 聚类分析 采用SPSS 16.0 统计软件组间平均链锁法进行分层聚类分析，Z score 法进行标准化处理，测度选用欧氏距离平方，结果见图1。表明，16 批治糜康栓样品聚为两大类，ZP1～ZP10（正品治糜康栓组）聚为一类，WP1～WP6（伪品治糜康栓组）聚为一类，表明两类治糜康栓样品中无机元素的含有量特征存在明显的差异。

图1 16 批样品聚类树状图Fig.1 Dendrogram of sixteen batches of samples

2.8 差异性无机元素识别［3-10］图2 表明，利用SIMCA-P 13.0 分析软件对16 个正品和伪品治糜康栓样品进行主成分分析，获得样品的主成分分析得分图，可知，16 批样品分为明显的 2 个区域，与聚类分析结果相同，其中正品治糜康栓分布在-2.93＜PC1＜-1.86，-1.07＜PC2＜2.20 的区域，伪品治糜康栓分布在 3.17＜PC1＜4.72，-4.04＜PC2＜2.52 的区域。各元素分布载荷图见图3，提示离中心较近的分布是正品治糜康栓和伪品治糜康栓两类样品中含有量相差较小的元素，离中心较远分布的为含有量相差较大的元素。通过t检验、秩和检验比较样品中差异性无机元素，共筛选出12种元素含有量具有显著性差异（P＜0.05），分别为 Be、Al、K、Mn、Fe、Ni、Ga、As、Sn、Ba、Tl、Pb。

表6 各无机元素含有量测定结果（mg／kg）Tab.6 Results of content determination of various inorganic elements（mg／kg）

图2 16 批样品主成分分析图Fig.2 PCA plot for sixteen batches of samples

2.9 无机元素特征谱建立［3-10］根据不同元素测定结果，筛选16种共有元素，取各元素含有量的平均值，建立正品治糜康栓和伪品治糜康栓的无机元素特征图谱。以便于绘图，纵坐标以对数Log10的形式表示。以方便比较，将正品、伪品治糜康栓的无机元素特征图谱集中绘制，见图4。可知，两类样品的无机元素特征图谱的走势存在差异，如K、Ga 处走势具明显差异，因此可以利用该特征图谱鉴别正品、伪品治糜康栓。

图3 16 批样品主成分分析载荷图Fig.3 Loadings scatter plot of principal component analysis of sixteen batches of samples

3 讨论

正品治糜康栓中 Cu、As、Cd、Hg、Pb 的平均含有量分别为 2.497、0.142、0.002、0.001、0.079 mg／kg，伪品治糜康栓中平均含有量分别为2.318、0.250、0.002、0.001、0.121 mg／kg。在2015年版《中国药典》（一部）收载的39种含矿物药外用制剂中，仅妇必舒阴道泡腾片有明确的Cu、As、Cd、Hg、Pb 限量规定，即 Cu ≤20 mg／kg、As≤2 mg／kg、Cd≤0.3 mg／kg、Hg≤0.2 mg／kg、Pb≤5 mg／kg。2007年版 《化妆品卫生规范》［15］中对 Hg、Pb、As 的限量值分别为 Hg≤1 mg／kg（含有机汞防腐剂的眼部化妆品除外）、Pb≤40 mg／kg、As≤10 mg／kg。参照上述标准，正品治糜康栓和伪品治糜康栓中重金属及有害元素的含有量均未超出限量要求。

图4 16 批样品无机元素特征图谱Fig.4 Characteristic spectrum of inorganic elements of sixteen batches of samples

通过微波消解ICP-OES／MS 技术对正品、伪品治糜康栓中18种无机元素进行含有量测定，正品治糜康栓中K 含有量最高，伪品治糜康栓Al 含有量最高。对16 批样品进行聚类分析，分为正品治糜康栓和伪品治糜康栓两类，并从中筛选得到12种含有量具有显著性差异（P＜0.05）的元素。正品、伪品治糜康栓差异性特征元素及无机元素特征谱，可作为治糜康栓质量控制手段之一。此外，正品、伪品治糜康栓中无机元素含有量及分布规律的差异性是否会对糜康栓的安全性与有效性产生影响，有待进一步深入研究。