罗汉果中罗汉果皂苷提取工艺的优化及其止咳祛痰作用

陈 敏，王翠红

（上海健康医学院附属周浦医院药剂科，上海 201318）

罗汉果Siraitia grosvenorii是我国特有药食同源植物，主要分布于广西、广东、湖南等省，其果实在我国已有三百多年的应用历史［1］，《中国药典》 记载其味甘、凉，归肺、大肠经，具有清热润肺、利咽开音、滑肠通便的作用，用于治疗肺热燥咳、咽痛失音、肠燥便秘［2］。现代药理研究表明，罗汉果甜苷具有调节血糖平衡、调节脂肪代谢、抗氧化及提高免疫等多种生物活性［3-5］；罗汉果中主要含有葫芦烷型三萜皂苷、黄酮苷、多糖等成分，其主要活性成分是葫芦烷型三萜苷类化合物，称为罗汉果苷［6-8］，它们因甜度高、热量低、色泽浅、稳定性好、食用安全，可作为甜味剂全部或部分替代蔗糖而广泛用于各类食品，在药食两用中药、功能食品、食品添加剂等方面前景广阔。

本实验拟选取罗汉果主要有效成分罗汉果皂苷V 含有量作为评价指标，在单因素实验基础上采用正交试验优化罗汉果皂苷提取工艺，并通过小鼠氨水引咳法、小鼠气管酚红法测定提取物止咳祛痰作用，为该药材开发利用提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器 Varian Cary 100 紫外分光光度计（美国Varian公司）；FA2004 电子天平（上海市安亭电子仪器厂）；ME204E 电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；HH-8 数显恒温水浴锅（常州市金坛科兴仪器厂）；电热鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）。

1.2 试药 罗汉果皂苷V 对照品（中国食品药品检定研究院，含有量≥98%）。罗汉果购自上海万仕诚有限公司，经专家鉴定符合2015年版 《中国药典》 一部项下有关规定。甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为纯化水。

1.3 动物 SPF 级 ICR 小鼠，雌雄各半，体质量 18～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于清洁级动物房，自由进食与饮水，温度（25±2）℃，相对湿度 40%～60%，人工照明模拟昼夜变化。本实验方案遵守动物保护、动物福利和伦理原则及相关规定。

2 方法与结果

2.1 提取液制备 称取药材粉末10 g，置于具塞试管中，加水提取，过滤，定容，即得。

2.2 总皂苷含有量测定

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取罗汉果苷V 对照品5.26 mg，加入 10 mL 量瓶中，甲醇溶解定容，即得（0.526 mg／mL）。

2.2.2 供试品溶液制备 精密量取罗汉果提取液10 mL，水饱和正丁醇溶液萃取 3 次，每次 10 mL，水浴挥干，残渣加甲醇定容至250 mL 量瓶中，摇匀，即得。

2.2.3 检测波长选择 精密量取对照品、供试品溶液各0.5 mL 于10 mL 具塞比色管中，水浴挥干甲醇，加入新鲜配制的 5% 香草醛-冰醋酸溶液 0.2 mL、高氯酸 0.8 mL，60 ℃水浴中加热15 min 后置于冰水中冷却3 min，再加5 mL 冰醋酸。以第 1 管为空白对照，在 200～600 nm 波长处扫描，发现在477 nm 处对照品、供试品溶液均有最大吸收，故选择其作为检测波长。

2.2.4 线性关系考察 精密量取对照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于 10 mL 具塞比色管中，水浴挥干甲醇，加入新鲜配制的5% 香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，60 ℃水浴中加热15 min 后置于冰水中冷却3 min，再加5 mL 冰醋酸，以第 1 管做空白对照，于 477 nm 波长处测定吸光度。以溶液质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A）进行回归，得方程为A= 0.006 3X-0.131（R2=0.999 4），在 34～105 mg／L 范围内呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 精密量取对照品溶液 6 份，按“2.2.4”项下方法显色，测定吸光度，测得其 RSD 为0.13%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 精密量取对照品溶液 6 份，按“2.2.4”项下方法显色，以空白溶剂为对照，于 0、1、2、4、8、12 h 测定吸光度，测得其 RSD 为 0.3% ，表明该方法稳定性良好。

2.2.7 加样回收率试验 量取罗汉果皂苷含有量已知的提取液5 份，加入罗汉果皂苷 V 对照品溶液，按 “2.2.4”项下方法显色，测定吸光度，计算回收率。结果，罗汉果皂苷平均加样回收率为97.66%，RSD 为0.63%。

2.3 单因素试验

2.3.1 浸泡时间 精密称取15 份样品粉末于具塞试管中，每份 10 g，加入 15 倍量水，每 3 份设置浸泡时间 0、30、60、90、120 min，提取时间 60 min，计算罗汉果皂苷含有量，结果见图1。由图可知，罗汉果皂苷含有量随浸泡时间增加而提高，但超过90 min 后趋势不明显，故选择30、60、90 min 进行正交试验。

图1 浸泡时间对罗汉果皂苷含有量的影响

2.3.2 料液比 精密称取12 份药材粉末于试管中，每份10 g，每 3 份设置料液比 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25，浸泡时间 60 min，提取时间 60 min，计算罗汉果皂苷含有量，结果见图2。由图可知，罗汉果皂苷含有量在料液比1 ∶5～1 ∶20 时提高，但超过 1 ∶20 后不再增加，故选择 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20 进行正交试验。

图2 料液比对罗汉果皂苷含有量的影响

2.3.3 提取时间 精密称取15 份药材粉末于试管中，每份 10 g，加入 15 倍量水，每 3 份设置提取时间 30、60、90、120、150 min，浸泡时间 60 min，计算罗汉果皂苷含有量，结果见图3。由图可知，罗汉果皂苷含有量在提取时间30～120 min 时提高，但超过90 min 后趋势不明显，故选择 30、60、90 min 进行正交试验。

图3 提取时间对罗汉果皂苷含有量的影响

2.3.4 提取次数 精密称取3 份药材粉末于试管中，每份10 g，加入 15 倍量水，浸泡时间 60 min，提取时间 60 min，过滤，得到第1 次提取后的浸提液和滤渣，重复2 次，将4次浸提液分别编号，计算罗汉果总皂苷含有量，结果见图4。由图可知，罗汉果总皂苷含有量随着提取次数增加而明显降低，故选择 1、2、3 次进行正交试验。

图4 提取次数对罗汉果皂苷含有量的影响

2.4 正交试验 在单因素试验基础上，选择料液比（A）、提取时间（B）、提取次数（C）、浸泡时间（D）作为影响因素，罗汉果皂苷V 含有量作为评价指标，L9（34）正交表优化提取工艺。因素水平见表1，结果见表2，方差分析见表3。

表1 因素水平

表2 试验设计及结果

表3 方差分析

由此可知，各因素影响程度依次为料液比＞提取次数＞提取时间＞浸泡时间，其中料液比对罗汉果皂苷V 含有量有显著影响（P＜0.05），最优工艺为 A2B2C3D2。考虑到浸泡时间的影响程度最低，并结合工业生产实际情况和成本，将最优工艺修正为 A2B2C3D1，即药材加 15 倍量水浸泡30 min 后提取 3 次，每次 60 min。

2.5 验证试验 按 “2.4”项下优化工艺进行3 批验证试验，结果见表4，可知该工艺稳定可行。

表4 验证试验结果（n=3）

表5 罗汉果提取物对小鼠咳嗽潜伏期、3 min 内咳嗽次数的影响（， n=10）

表5 罗汉果提取物对小鼠咳嗽潜伏期、3 min 内咳嗽次数的影响（， n=10）

注：与空白组比较，∗P＜0.05

组别 剂量 咳嗽潜伏期／s 3 min 咳嗽次数／次 止咳率／%空白组 20 mL／kg 73.48±23.81 5.18±1.26 —阳性对照组 30 mg／kg 100.47±45.39∗ 2.05±2.76 65.34罗汉果提取物低剂量组 25 g／kg 92.09±61.29 4.79±6.41 29.37罗汉果提取物高剂量组 50 g／kg 103.62±51.4∗ 2.87±2.32∗ 47.32

2.6 止咳祛痰作用测定

2.6.1 小鼠氨水引咳法 40 只小鼠随机分为空白组（等溶剂蒸馏水）、阳性对照组（复方磷酸可待因）及罗汉果提取物低、高剂量组（25、50 g／kg），每组 10 只，灌胃给药，给药体积 0.02 mL／g，1 次／d，连续 5 d，末次给药前禁食不禁水12 h。末次给药1 h 后，将小鼠放入加有浓氨水的多功能诱咳引喘仪中雾化20 s，记录咳嗽潜伏期（从喷雾开始至发生咳嗽的时间）、3 min 内咳嗽次数，结果见表5。由表可知，与空白组比较，罗汉果提取物高剂量组小鼠咳嗽潜伏期显著延长（P＜0.05），3 min 内咳嗽次数显著降低（P＜0.05）。

2.6.2 小鼠气管酚红法 40 只小鼠随机分为空白组、氯化铵组（15 mg／kg）及罗汉果提取物低、高剂量组（25、50 g／kg），每组 10 只，灌胃给药，给药体积 0.02 mL／g，1 次／d，连续 5 d，末次给药前禁食不禁水 12 h。末次给药1 h 后，小鼠腹腔注射 0.5% 酚红溶液（0.01 mL／g），1 h 后处死，剥离气管周围组织，剪下甲状软骨至气管分支处的一段气管，置于含有2 mL 生理盐水的试管中，加入0.1 mL 5%碳酸氢钠溶液，离心 30 min，分离上清液，546 nm 波长处测定吸光度，结果见表6。由表可知，与空白组比较，罗汉果提取物组酚红质量浓度显著增加（P＜0.05），以高剂量组更明显。

表6 罗汉果提取物对小鼠气管酚红分泌量的影响（，n=10）

表6 罗汉果提取物对小鼠气管酚红分泌量的影响（，n=10）

注：与空白组比较，∗P＜0.05

组别 剂量 酚红／（mg·L-1）空白组 20 mL／kg 4.23±0.84氯化铵组 15 mg／kg 6.25±2.17罗汉果提取物低剂量组 25 g／kg 6.06±0.95∗罗汉果提取物高剂量组 50 g／kg 6.33±1.57∗

3 讨论

罗汉果皂苷为葫芦烷型三萜烯葡萄糖苷，极性较大，提取溶剂主要为水、乙醇或两者混合溶剂，提取方法主要为直接溶剂提取、超声提取、微波提取［9］。韦文俊等［10］采用正交试验优化罗汉果甜苷V 提取工艺，发现与50%乙醇回流提取比较，水煎煮法提取后其含有量较高；邓福礼等［11］采用微波辅助浊点萃取法比较乙醇、甲醇、水、非离子表面活性剂GX-080 和TX-100 对罗汉果皂苷V 提取率的影响，发现该成分在乙醇中溶解度很低，含有量仅为2.8 mg／g，在水中达 12 mg／g，而在 GX-080、TX-100 中更高，分别为 13.07、12.87 mg／g，故综合考虑经济成本、操作难易度等因素，本研究选择水作为溶剂。结果表明，罗汉果中罗汉果皂苷最优提取工艺为加15 倍量水浸泡30 min后提取3 次，每次60 min，该工艺稳定可行，适合工业化生产，并且50 g／kg 提取物具有一定镇咳祛痰作用。

近年来，罗汉果苷降血糖、降脂、抗氧化、抗炎等多种生理活性被不断证实，在养生保健方面的研发中显示出重要地位，目前已有一些产品上市［12-13］，但总体上数量还较少，尚有待进一步探索。