鼻宁喷雾剂对急性鼻窦炎大鼠的治疗作用

王 森，欧水平，陈 莉，吕佳佳，王治凯，熊永爱∗

（1.遵义医科大学，贵州 遵义 563003；2.遵义医科大学附属医院药剂科，贵州 遵义 563099）

鼻宁喷雾剂是由鹅不食草、一枝黄花经水提醇沉而制得的鼻科苗药独家品种，具有疏风解表、清热通窍之功效，临床主要用于急性、慢性单纯性和过敏性鼻炎治疗［1-2］。研究表明，鼻炎和鼻窦炎发病机制密切相关，前者是指以鼻腔黏膜炎症为特征的病症；后者是指以鼻窦黏膜炎症为特征的病症，常继发于前者，在大多数个体中两者通常共存，故鼻-鼻窦炎是指以鼻腔和鼻窦黏膜炎症为特征的病症，治疗时先以药物控制鼻腔和鼻窦炎症至关重要［3-4］。但目前国内外未见鼻宁喷雾剂用于治疗鼻窦炎的报道，故本实验研究该制剂对急性鼻窦炎大鼠的治疗作用，从而为其鼻科适应症的拓展奠定基础，对拓展其临床适应证、扩大优质品种的市场占有率也具有重要意义。

1 材料

1.1 动物 清洁级 SD 大鼠，雄性，体质量 180～220 g，购自第三军医大学大坪医学实验动物中心，许可证号SCXK（渝）2010-0005。

1.2 试药 鹅不食草、一枝黄花购自贵州省毕节市玲源中药材行，经遵义医学院杨建文老师鉴定分别为鹅不食草Centipeda minima（L.）A.Br.et Aschers.、一 枝 黄 花Solidago decurrensLour.的干燥全草。丙酸氟替卡松鼻喷雾剂（批号H20091100，英国葛兰素史克公司）。大鼠TNF-α ELISA 试剂盒（批号 ADI-900-086A）、IL-6 ELISA 试剂盒（批号ADI-900-045）（欣博盛生物科技有限公司）。绿原酸、芦丁对照品（批号分别为 110753-201415、100080-201409，中国食品药品检定研究院）；异绿原酸A 对照品（批号151028，成都普菲德生物技术有限公司）。乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯；水为重蒸水。

1.3 仪器 Agilent 1260 液相色谱仪，配置 DAD 检测器（美国 Agilent 公司）；BT125D 电子天平（德国 Sartorius 公司）；JA1002 电子天平（上海蒲春计量仪器有限公司）；98-II-B 磁力搅拌电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；RE-2000A 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；Exceed-Cd-20 实验室超纯水机（成都艾科水处理设备有限公司）；MK3 型多功能酶标仪（美国 Thermo Fisher 公司）；BA200 Digital 数码三目摄像显微摄像系统（麦克奥迪实业集团有限公司）。

2 方法

2.1 喷雾剂制备 取鹅不食草120 g、一枝黄花500 g，加水浸润12 h，水蒸气蒸馏，收集芳香水约为药材的3 倍量，药渣加水蒸煮 3 次，第 1 次 2 h，第 2、3 次各 1.5 h，合并煎煮，滤过，滤液浓缩至相对密度为 1.15（60 ℃）的清膏。芳香水加10 g 聚山梨酯 80，加入清膏，搅匀，加 9 g氯化钠调节等渗后加入山梨酸，用磷酸氢二钠调pH 至4.0～6.0，加水至 1 000 mL，搅匀，静置，取上清液，按每瓶 10 mL 灌装至喷瓶中，即得［1］。

2.2 绿原酸、芦丁、异绿原酸A 含有量测定

2.2.1 溶液制备 精密称取绿原酸、芦丁、异绿原酸A 对照品适量，50%甲醇制成每1 mL 分别含三者140、403.6、322.56 μg 的对照品溶液。将喷雾剂用 0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2.2 色谱条件［5］Neptune C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.2% 磷酸（B），梯度洗脱（0～15 min，10%～15%A；15～25 min，15%～20%A；25～55 min，20%～35%A；55～65 min，35%～10%A）；体积流量 1.0 mL／min；检测波长 326 nm；柱温 25 ℃；进样量10 μL。

2.2.3 线性关系考察 取 “2.2.1”项下对照品溶液，50%甲醇逐级2 倍稀释，在 “2.2.2”项色谱条件下进样测定，以峰面积（Y）对质量浓度（X）进行线性回归。

2.2.4 精密度、稳定性、重复性试验 在 “2.2.2”项色谱条件下，取同一供试品溶液进样测定6 次，考察精密度；于 0、2、4、6、8、12 h 进样测定，考察稳定性；取同一批喷雾剂，按 “2.2.1”项下方法平行制备6 份供试品溶液，进样测定，考察重复性。

2.2.5 加样回收率试验 精密量取绿原酸、芦丁、异绿原酸 A 含有量已知的喷雾剂6 份，每份2 mL，置于 10 mL 量瓶中，精密加入对照品溶液适量，蒸馏水稀释至刻度，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，按 “2.2.2”项下色谱条件进样测定，计算回收率。

2.2.6 样品含有量测定 取喷雾剂，按 “2.2.1”项下方法制备供试品溶液，在 “2.2.2”项色谱条件下进样测定，外标法计算含有量。

2.3 模型建立 依据Ge 等［6］报道的方法并加以改进，取大鼠70 只，腹腔注射盐酸氯胺酮 0.5 mg／kg，必要时用一般剂量重复1 次，进行全麻；盐酸利多卡因20 mg／mL 加肾上腺素0.125 mg，进行鼻背下注射麻醉，剃毛，碘伏消毒备皮，在鼻中线上中 1／3 交界处旁开 3 mm，以 45°进针1.5 mm，置石蜡适量于内封口，然后塞入适量带有金黄色葡萄球菌的明胶海绵于内，由于是微创，不必缝合，上述过程在显微镜下操作以确保操作准确性，以喷嚏、流涕、鼻腔分泌物等为评价标准判断模型成功与否。

2.4 分组与给药 取造模成功的大鼠50 只，按体质量和鼻窦炎评分标准（≥6 分）随机分为 5 组，每组 10 只，分别为模型组（生理盐水）、阳性组（40 μg／kg 丙酸氟替卡松鼻喷雾剂）、鼻宁喷雾剂高剂量组（0.182 g／kg）、鼻宁喷雾剂中剂量组（0.091 g／kg）、鼻宁喷雾剂低剂量组（0.045 5 g／kg），另取 10 只正常大鼠作为正常组，各组通过鼻腔滴鼻给药，2 次／d（早晚各 1 次），连续 14 d。第 15天，大鼠股动脉取血，3 000 r／min 离心 10 min，收集上清液，-20 ℃保存待测，再断颈处死大鼠，剖取鼻窦黏膜（手术刀划取左侧窦口1 mm×1 mm 黏膜）。

2.5 指标检测

2.5.1 鼻部外观体征及鼻窦炎症状评分 造模、给药后，观察大鼠鼻部症状和体征，主要包括鼻痒、喷嚏、流涕等，分别与给药前后观察记录各实验组大鼠鼻窦炎症状，并按表1 评分标准进行评分［7］。

表1 鼻窦炎症状评分标准

2.5.2 鼻窦黏膜病理组织学检查 将大鼠鼻窦黏膜组织按病理检验 SOP 程序进行脱水、修剪、包埋、切片、染色、封片等，最后镜检。数码3 目摄像显微摄像系统对切片进行图像采集，每张切片先于40 倍下观察全部组织大体病变，再采集100、400 倍图片观察具体病变。

2.5.3 血清TNF-α、IL-6 水平测定 取大鼠股动脉血液，3 000 r／min 离心 10 min，取上清液，ELISA 法检测血清TNF-α、IL-6 水平。

2.6 统计学分析 通过SPSS 软件进行处理，数据以（）表示，组间采用单因素方差分析，方差齐者进行LSD 检验，方差不齐者进行 Tamhane’s T2 检验，以P＜0.05 为有显著性差异；等级资料比较采用非参数检验方法Kruskal-Wallis H 检验，组间两两比较采用 Nemenyi 检验，α=0.05，以P＜0.05 为有显著性差异。

3 结果

3.1 方法学考察与含有量测定 HPLC 色谱图见图1。绿原酸、芦丁、异绿原酸A 回归方程分别为Y=28.277 2X＋621.641 7（r= 1.000 0）、Y= 11.075 8X-3.900 0（r=1.000 0）、Y=38.258 7X-415.087 5（r=0.999 3），线性范围 分 别 为 8.75～140、25.225～403.6、20.16～322.56 μg／mL。精密度、稳定性、重复性试验的 RSD 均未超过0.57%（n=6），供试品在 12 h 内稳定性良好；平均加样回收率97.76%～101.74%，RSD≤2.08%（n=6）。绿原酸、芦丁、异绿原酸 A 含有量分别为 24.75、133.06、71.31 μg／mL，符合鼻宁喷雾剂质量标准。

图1 各成分HPLC 色谱图

3.2 外观体征、鼻窦炎评分、病理损伤评分 除正常组外各组大鼠造模后均抓挠鼻、面不止，到处摩擦、打喷嚏，有鼻涕流出，治疗10 d 后明显好转；与模型组比较，给药组大鼠打喷嚏、流鼻涕情况明显减轻，其中鼻宁喷雾剂给药高剂量组、阳性组整体状态最好。表2显示，造模后各组鼻窦炎评分较造模前显著升高（P＜0.01），而给药后鼻宁喷雾剂组该评分较模型组显著降低（P＜0.05）。

图2显示，模型组大鼠鼻窦黏膜组织黏膜上皮和固有层排列、分界清晰，黏膜层和黏膜下层分界不清，黏膜层显著增厚，黏膜上皮细胞脱落或溃烂，黏膜层和黏膜下层大量的炎细胞浸润，其中包括较多的淋巴细胞和中性粒细胞；鼻宁喷雾剂组大鼠黏膜上皮和固有层排列、分界清晰，纤毛上皮排列整齐，偶见有个别组织内可见炎细胞浸润。再对大鼠鼻窦黏膜组织炎性损伤情况按文献［8］标准进行评分，结果见表2，可知与正常组比较，模型组大鼠鼻窦黏膜组织炎性病变显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，鼻宁喷雾剂组大鼠其炎性损伤显著减少（P＜0.05）。

表2 鼻宁喷雾剂对大鼠鼻窦炎评分与鼻窦黏膜组织炎性损伤评分的影响（， n=10）

表2 鼻宁喷雾剂对大鼠鼻窦炎评分与鼻窦黏膜组织炎性损伤评分的影响（， n=10）

注：与正常组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，∗P＜0.05

组别 鼻窦炎评分给药前 给药后 鼻窦黏膜组织炎性损伤评分正常组 0.13±0.012 0.11±0.015 1.39±0.51模型组 7.48±0.37△△ 7.23±0.56△△ 12.68±3.81△△阳性组 7.52±0.61△△ 2.68±0.19∗ 5.76±0.21∗鼻宁喷雾剂高剂量组 7.29±0.78△△ 2.12±0.15∗ 5.40±0.63∗鼻宁喷雾剂中剂量组 7.67±0.43△△ 2.09±0.16∗ 6.20±0.83∗鼻宁喷雾剂低剂量组 7.44±0.36△△ 2.87±0.19∗ 7.60±0.82∗

图2 各组大鼠鼻窦黏膜组织病理学变化（HE，×400）

3.3 TNF-α、IL-6 水平 表3显示，与正常组比较，模型组 TNF-α、IL-6 水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，鼻宁喷雾剂两者水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 鼻宁喷雾剂对TNF-α、IL-6 水平的影响（，n=10）

表3 鼻宁喷雾剂对TNF-α、IL-6 水平的影响（，n=10）

注：与正常组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，∗ P＜0.05，∗∗P＜0.01

组别 TNF-α／（pg·mL-1）IL-6／（pg·mL-1）正常组 9.96±1.14 8.43±2.84模型组 23.18±3.32△△ 18.43±3.12△△阳性组 13.31±2.56∗∗ 8.91±2.15∗鼻宁喷雾剂高剂量组 14.18±2.13∗∗ 8.97±2.34∗∗鼻宁喷雾剂中剂量组 15.69±2.85∗∗ 11.24±2.41∗鼻宁喷雾剂低剂量组 17.32±1.92∗ 13.19±1.97∗

4 讨论

鼻窦炎是耳鼻喉科多发病，我国发病率为8%～15%，且极易复发，难以治愈，其病因复杂，发病机制尚不明确，可能与感染、纤毛功能不良、变态反应、环境因素、细菌生物膜等多种因素有关。目前，鼻窦炎的治疗仍以鼻内镜外科手术及抗炎药物为主，存在创伤性大、复发率高、抗生素和糖皮质激素耐药性与不良反应等一系列问题［9-10］。

鼻腔外侧壁存在着1 个不稳定组织微环境，能在诱导因子作用下分泌多种细胞因子，使得腺细胞、上皮细胞等增殖，并激活嗜酸性粒细胞等分泌炎性介质，从而导致鼻窦炎发生［11］，其中 TNF-α、IL-6 是公认的与局部炎症反应有关的细胞因子，对鼻窦炎发生发展及病理变化有着直接而重要的影响［12-13］。其中，TNF-α 是初级炎性因子，具有多种促炎生物活性，能有效诱导包括自身在内的多种细胞因子，并活化各种炎性细胞，促进血管内皮细胞黏附白细胞，导致白细胞在炎性反应部位聚集，并促进血管通透性显著性增加，从而加重炎症损伤［14］；感染性疾病的发生和发展与IL-6 升高有着密切关系，它是具有促进炎性反应的细胞因子，可增强炎症介质对组织的损害，可通过P13 K／Akt 信号通路选择性激活 GSK3β 而增强炎症反应［12］。

本实验发现，大鼠感染鼻窦炎后可引起血液异常分泌TNF-α、IL-6 等促炎因子，导致促炎因子、抑炎因子平衡被打破，使得后者分泌相对不足，鼻窦产生较强的炎症反应；鼻宁喷雾剂可明显抑制上述促炎因子分泌，减少鼻窦黏膜组织炎性损伤，从而对大鼠鼻窦炎症状产生治疗效果，可为拓展该制剂新适应症、实现临床应用价值最大化提供理论依据。