参附注射液联合左旋多巴对帕金森病小鼠黑质组织形态及酪氨酸羟化酶水平的影响

吴 艳，杜 娟，张晓雷

（南京医科大学附属脑科医院，江苏 南京 210029）

帕金森病是世界公认的第二大神经退行性疾病，但机制尚不明确［1］，其病理特点为脑中黑质多巴胺能神经元进行性死亡，导致黑质-纹状体通路DA 合成减少直至不足，从而引起机体静止震颤、肌强直、运动迟缓等运动症状［2］。多巴胺能神经元损伤导致多巴胺合成减少是发病的中心环节［2］，酪氨酸羟化酶（TH）是多巴胺合成限速酶，神经元摄取血中酪氨酸后通过TH 合成多巴，再经多巴脱羧酶生成多巴胺以维持正常机体功能［3］，故TH 的功能和表达对多巴胺合成有重要意义［4］。

目前，左旋多巴替代疗法是临床最常用的帕金森病治疗方案，它可补充纹状体中多巴胺不足，对肌强直和运动困难疗效较好［5］，但使用过程中因为血浆Hcy 水平升高，易出现血管平滑肌细胞增生、氧化应激反应、动脉粥样硬化形成，甚至失眠、抑郁、幻觉等中枢神经系统症状［6］，这与长期使用左旋多巴类药物疗效下降，甚至药物不良反应增加有关，故该疗法有其局限性［7］。参附注射液可缓解气虚、阳虚症状，具有抗缺血、缺氧等作用，其主要成分是红参和附片，可用于治疗缺血缺氧导致的心脑血管疾病［8］，本实验探讨该制剂联合左旋多巴对帕金森病小鼠黑质组织形态及酪氨酸羟化酶水平的影响，以期为相关治疗提供参考。

1 材料

1.1 动物 健康 C57／BL6 小鼠，体质量（20±2）g，雌雄各半，购自上海灵畅生物科技有限公司，生产许可证号SCXK（沪）2013-0018，饲养于中美冠科生物技术有限公司动物实验室，使用许可证：SYXK（苏）2014-0047，温度（22±1）℃、相对湿度（60±5）%，自由摄食饮水。

1.2 仪器 680 酶联免疫检测仪（上海众生声明科学发展有限公司）；BSA124S 电子分析天平［塞多利斯科仪器（北京）有限公司］；D3024R 微量高速冷冻离心机（美国Scilogex 公司）；ELX808 酶标仪（美国 BioTek 公司）；Basic164-5050 电泳电源、TY10165-8001 垂直电泳槽、GelDoc凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）；YD-1508A 石蜡切片机（金华市益迪医疗设备厂）；Axioplan 2 imaging 光学显微镜（德国Carl Zeiss Jena 公司）。

1.3 试药 参附注射液［华润三九（雅安）药业有限公司，批号17040205004］；左旋多巴片（浙江远力健药业有限责任公司，批号 170701）；1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP，东京化成工业株式会社，批号 JBVHJCB）；小鼠酪氨酸羟化酶（TH）ELSIA 检测试剂盒（武汉伊艾博科技有限公司，批号2620187320）；Rabbit tyrosine hydroxylase 抗体［爱必信（上海）生物科技有限公司，批号 34i7370］；Rabbit GAPDH 抗体（美国 Bioworld 公司，批号 AA0101）；goat anti Rabbit IGg（美国 Bioworld 公司，批号CJ4422）；DAB显色试剂盒（碧云天生物技术有限公司，批号033016160503）。

2 方法

2.1 分组、给药、造模 30 只雄性小鼠，随机分为 5 组，每组6 只，分别为对照组（腹腔注射生理盐水）、模型组（腹腔注射 25 mg／kgMPTP）、参附注射液组（腹腔注射8 mg／kg）、左旋多巴组（灌胃 25 mg／kg）、参附注射液＋左旋多巴组（腹腔注射 8 mg／kg＋灌胃 25 mg／kg）。除对照组外，其余各组小鼠腹腔注射25 mg／kg MPTP 7 d 以建立帕金森病模型，给药14 d 后进行实验。

2.2 小鼠行为学检测

2.2.1 爬杆实验 选择50 cm 长、1 cm 粗的木杆作为爬杆，顶端固定直径2 cm 的泡沫塑料小球，爬杆上缠绕医用胶布以防止打滑。实验前1 周，每天进行1 次爬杆训练，最后1 次给药后进行检测，将小鼠放至球顶使其爬下，以小鼠双前肢接触杆底平台为完成爬杆，记录爬完所需的时间。每只小鼠爬杆5 次，取平均值。

2.2.2 悬挂实验 实验前1 周，每天将小鼠2 只前爪悬挂于水平线上停留10 s，给药结束后进行检测。如小鼠在10 s内用 2 只后爪抓住线，记 3 分；1 只后爪抓住线，记 2 分；2 只后爪均抓不住线，记 1 分；小鼠跌落，记 0 分。

2.3 血清及脑组织TH 水平检测 小鼠行为学实验后颈动脉取血，脱颈处死，冰上取出黑质区新鲜脑组织置于冻存管中，液氮速冻后，放入-80 ℃冰箱中保存。ELISA 试剂盒检测血清及黑质区脑组织TH 水平，具体操作方法参考说明书。

2.4 组织切片及染色 小鼠行为学实验后颈动脉取血，脱颈处死，冰上取出大脑，迅速放入多聚甲醛溶液中固定，制备蜡块，切片后脱蜡复水，HE 染色，脱水后封片，光镜观察。再免疫组化染色，切片复水后，3% H2O2中灭活组织切片中的内源性过氧化物酶，清洗后进行抗原修复，山羊血清滴封闭，一抗4 ℃下过夜，二抗37 ℃下孵育1 h，滴加DAB显色液染色，苏木素复染，脱水后封片，光镜观察。通过Image pro plus 软件统计各图片中蛋白阳性表达的平均光密度值，导出数据，Excel 软件处理，SPSS 软件进行统计。

2.5 大脑黑质组织TH 蛋白水平检测 采用Western blot法。精密称取小鼠脑组织，裂解，BCA 法检测蛋白浓度，根据目的蛋白的分子量制备合适浓度的SDS-PAGE 凝胶，加样后通电，进行垂直电泳，蛋白被适当分离后停止，冰浴，湿法转膜，封闭 1 h 以上，加入稀释好的一抗，4 ℃摆摇床上缓慢摇动孵育过夜，加入稀释好的二抗，室温下孵育2 h，洗涤3 次，采用凝胶成像系统软件进行化学发光成像，拍照并保存。

2.6 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理，数据以（）表示，组内或组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 具有统计学意义。

3 结果

3.1 参附注射液对小鼠行为学的影响 表1显示，与对照组比较，模型组小鼠爬杆时间显著延长（P＜0.01），悬挂实验得分显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠爬杆时间显著缩短（P＜0.05，P＜0.01），悬挂实验得分显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 参附注射液对小鼠行为学的影响（， n=6）

表1 参附注射液对小鼠行为学的影响（， n=6）

注：与对照组比较，## P＜0.01；与模型组比较，∗ P＜0.05，∗∗P＜0.01

组别 爬杆时间／s 悬挂实验得分／分对照组 7.8±1.3 2.5±0.3模型组 15.7±1.4## 0.8±0.5##参附注射液组 11.1±1.3∗ 1.8±0.6∗∗左旋多巴组 10.8±1.6∗ 1.9±0.7∗∗参附注射液＋左旋多巴组 9.7±1.9∗∗ 2.0±0.8∗∗

3.2 参附注射液对小鼠黑质神经元的影响 图1显示，对照组小鼠黑质致密度神经元数量丰富，胞体较大，多为椭圆形，胞浆染色较淡，细胞核染清晰；模型组小鼠部分神经元胞体深染，胶质细胞增生，神经元数目减少；参附注射液组、左旋多巴组视野内小鼠黑质正常神经元平均数量均明显高于模型组，形态上可观察到2 组黑质残存的神经元较多，细长、胞体深染的神经元数量较少，胶质细胞增生得到改善；参附注射液＋左旋多巴组小鼠黑质正常神经元数目仅次于对照组，少部分黑质细胞黑色素减少，少部分神经元胞体深染，胞核浓染。

图1 各组小鼠黑质HE 染色

3.3 参附注射液对TH 水平的影响 表2显示，与对照组比较，模型组TH 水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，给药组其水平显著升高（P＜0.01）。

表2 参附注射液对TH 水平的影响（， n=6）

表2 参附注射液对TH 水平的影响（， n=6）

注：与对照组比较，## P＜0.01；与模型组比较，∗ P＜0.05，∗∗P＜0.01

组别 血清 TH／（pg·mL-1）黑质 TH／（ng·g-1）对照组 1 443.5±137.6 3.012±0.268模型组 621.0±78.4## 1.359±0.144##参附注射液组 912.8±103.1∗ 2.217±0.192∗∗左旋多巴组 986.4±96.9∗ 2.109±0.255∗∗参附注射液＋左旋多巴组 1 145.5±112.3∗∗ 2.538±0.245∗∗

3.4 参附注射液对TH 蛋白表达的影响 图2显示，与对照组比较，模型组小鼠大脑黑质区TH 蛋白表达显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，给药组其蛋白表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

4 讨论

流行病学调查表明，在60 岁以上人群中帕金森病患病率为1%，并且每年新增患者 10 万以上［9］，既往临床研究表明，左旋多巴制剂可引起周围性、中枢性2 类不良反应［10］，故减少及延迟其不良反应发生，改善其对脑中黑质多巴胺能神经元的毒性作用，是临床关注热点。帕金森病主要病理基础是黑质多巴胺能神经元进行性死亡，造成TH表达和数量下降，最终导致合成减少黑质-纹状体多巴胺浓度不足，引起运动症状［11］，目前还没有针对多巴胺能神经损伤的保护药物。

图2 参附注射液对TH 蛋白表达的影响

中医认为，帕金森病属于 “颤证”“痹症”范畴，因为邪风、邪热、邪湿阻滞经络，加之老年人气血不足，难以温养筋脉；病久入络，瘀血内阻，血行不畅，导致肢体震颤、痉挛、麻痹等症状，主病在肝，病久涉及脾胃，其病位在脑髓、筋脉，表明该疾病发生不仅与肝之疏泄失常、脾虚失运有联系，也与老年人气血两虚密切相关［12］。中药具有安全性高的优势，在帕金森病临床治疗中受到越来越多的重视，如银杏平颤方、肉苁蓉等［13-14］；参附注射液含有人参和附片。临床研究显示其对神经、心血管、免疫系统功能具有不同程度的保护作用［8，15］，其中人参皂苷是人参主要活性成分，参附注射液中其含有量＞0.8 mg／mL，可通过激活神经细胞存活机制和神经保护机制，从而发挥促进神经发育、调控神经递质、改善学习与记忆能力的作用［16］，还有抗疲劳、增强心肌功能，能保护自身免疫系统，促进物质代谢和抗氧化，同时可提高机体适应性，有升压、稳压等作用［17］；附片所含乌头碱可兴奋迷走神经加快心率，有明显升血压的作用，对阳虚、痹症有效。

本实验应用MPTP 致小鼠帕金森模型，研究参附注射液单独应用及联合左旋多巴时对帕金森病小鼠的治疗作用。结果显示，参附注射液可明显缩短小鼠爬杆时间，提高小鼠悬挂实验得分；参附注射液、左旋多巴及两者联用时均对小鼠有神经保护作用，并且能明显提高血清、大脑黑质区TH 水平及黑质区TH 蛋白表达，以联合应用更强，表明参附注射液对帕金森病小鼠有较好的治疗效果，而且联合左旋多巴时作用更强。