远志皂苷预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤及高迁移率族蛋白B1表达的影响

李海艳，迟艳飞

（1.白城医学高等专科学校，吉林 白城 137000；2.吉林省人民医院，吉林 长春 130000）

心血管疾病发病率、死亡率高，严重威胁人类健康，而心肌缺血是心血管疾病最常见的致病因素之一［1］，当心肌缺血发生时，临床上大多采用溶栓或心脏搭桥等手段使血管再通，恢复心脏血流供应，即为心肌缺血再灌注［2］，但大量研究发现，短期内迅速恢复缺血心肌的血液供应会使缺血性心肌损伤加重，出现心脏衰竭、心肌梗死面积增大、心律失常等更严重的病理现象，被称为心肌缺血再灌注损伤［3］，故改善心肌缺血再灌注损伤类药物的研究开发将对心肌缺血患者的治疗具有重要意义。

HMGB1 为非组织核蛋白，高度保守，在真核细胞的胞核内广泛存在，在正常生理状态下具有核结合蛋白的作用，而在病理状态下可通过被动释放和主动分泌的方式从细胞核内进入细胞间隙，进而引发炎症反应［4］。作为一种新型的促炎因子，HMGB1 在心肌缺血再灌注损伤进程中发挥重要作用，并与 TNF-α、IL-6 和 iNOS 等炎症因子存在交叉联系［5］。

远志始载于 《神农本草经》，为远志科植物远志Polygala tenuifoliaWilld.的干燥根，具有安神益智、消肿、祛痰之功效，临床上主要用于治疗乳房肿痛、疮疡肿毒、咳痰不爽、神志恍惚、健忘惊悸等症［6］，远志皂苷为其主要活性成分，具有抗衰老、改善学习记忆、抗肿瘤等多种药理作用［7-9］，近期研究发现［10-11］，它对大鼠、鼠的心肌缺血再灌注损伤均具有明显保护作用，可通过抗心肌细胞凋亡、抗氧化等机制发挥作用。本实验将在明确远志皂苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的基础上，探讨该成分对炎症反应及HMGB1 表达的影响，为其进一步应用奠定基础。

1 材料

1.1 试药 远志皂苷（含有量＞95%），批号20160514，由成都普菲德生物技术有限公司提供。尼莫地平（规格20 mg／片），由广东隆信制药有限公司生产，批号151120；CPK、LDH 检测试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司；TNF-α、IL-6、iNOS 检测试剂盒购自北方生物技术研究所；HMGB1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体分别购自英国Abcam 公司、北京华肽先锋生物科技有限公司。

1.2 仪器 BIOPAC 多导（16 道）生理记录仪，购自北京普升达科贸有限公司；DW-3000 小动物人工呼吸机，购自安徽正华生物仪器设备有限公司；WD-2102A 全自动酶标仪，购自北京六一仪器厂；7600S 紫外-可见分光光度计，购自上海菁华科技仪器有限公司；蛋白垂直电泳系统，购自美国Bio-Rad 公司。

1.3 动物 清洁级SD 大鼠，购自北京维通利华公司，许可证号 SCXK（京）2012-0001。

2 方法

2.1 分组及给药 大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、尼莫地平（21.6 mg／kg）组及远志皂苷高（80 mg／kg）、低（40 mg／kg）剂量组，每组 10 只，腹腔注射给药，1 次／d，给药体积均为 0.2 mL／100 g，其中假手术组、缺血再灌注组大鼠腹腔注射等体积溶剂，给药周期14 d。

2.2 模型制备及心脏功能检测 于末次给药30 min 后开始造模，腹腔注射2%戊巴比妥钠使大鼠麻醉，气管插管后连接动物人工呼吸机（潮气量1.5～2 mL／100 g，频率48～54 次／min）。小心分离右颈总动脉，在左心室内插管，切口处位于胸骨正中，左缘3～4 肋间位置处开胸，暴露心脏，使心包膜完全打开。除假手术组外，其余各组大鼠均在左心耳后左冠状动脉前降支下的位置处穿0 号线，结扎30 min 后进行120 min 再灌注，生理记录仪检测各组大鼠缺血后、再灌注后LVEDP 和LVSP，评价心脏功能。

2.3 心肌梗死面积测定 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法结合Image Pro-Plus 软件计算梗死面积和缺血区面积，心梗面积=梗死面积／缺血区面积×100%。

2.4 CPK、LDH 活性及 TNF-α、IL-6、iNOS 水平 缺血30 min 再灌注120 min 后，大鼠颈总动脉采血，常规方法分离血清，酶联免疫法检测CPK、LDH 活性，分光光度法检测 TNF-α、IL-6、iNOS 水平。

2.5 HMGB1 表达检测 缺血30 min 再灌注 120 min 后，立即取大鼠左心室缺血区心肌组织100 mg，磷酸盐缓冲液漂洗后加入组织裂解液，冰上裂解30 min，离心后二喹啉甲酸（BCA）法测定总蛋白含由量。取总蛋白20 μg，进行12%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转膜、封闭后依次加入 HMGB1（1 ∶500）、GAPDH 多克隆抗体（1 ∶2 000）、辣根过氧化酶标记的二抗，增强化学发光法（ECL）显色，通过 HMGB1 条带、内参 GAPDH 条带灰度值的比值进行半定量分析。

2.6 统计学分析 通过SPSS 15.0 软件进行处理，数据以（）表示；组间两两比较采用 SNK-q 法，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 远志皂苷对大鼠心脏功能的影响 表1显示，缺血30 min、再灌注180 min 后与假手术组比较，缺血再灌注组LVEDP显著升高（P＜0.05），LVSP显著降低（P＜0.05）；与缺血再灌注组比较，尼莫地平组、远志皂苷组LVEDP显著降低（P＜0.05），LVSP显著升高（P＜0.05）。

表1 远志皂苷对大鼠心脏功能的影响［mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），， n=10］

注：与假手术组比较，∗P＜0.05；与缺血再灌注组比较，#P＜0.05；—表示无

组别 剂量／（mg·kg-1）LVSP缺血30 min 再灌注180 min 缺血30 min 再灌注180 min LVEDP假手术组 — 7.51±1.54 5.76±0.84 115.34±13.23 118.15±12.28缺血再灌注组 — 36.72±5.26∗ 34.32±5.77∗ 52.80±8.65∗ 67.02±7.61∗尼莫地平组 21.6 20.56±4.74# 14.85±2.85# 80.86±10.46# 95.64±11.30#远志皂苷高剂量组 80 24.67±4.13# 19.41±3.31# 76.92±9.28# 83.53±9.38#远志皂苷低剂量组 40 29.48±3.82# 24.17±2.24# 72.79±10.62# 74.51±8.77#

3.2 远志皂苷对心肌梗死面积及 CPK、LDH 活性的影响 表2显示，与假手术组比较，缺血再灌注组心肌梗死面积显著增加（P＜0.05）；与缺血再灌注组比较，尼莫地平组、远志皂苷组其面积明显减少（P＜0.05）。与假手术组比较，缺血再灌注组 CPK、LDH 活性显著增加（P＜0.05）；与缺血再灌注组比较，尼莫地平组、远志皂苷组两者活性显著降低（P＜0.05）。

表2 远志皂苷对心肌梗死面积及CPK、LDH 活性的影响（， n=10）

表2 远志皂苷对心肌梗死面积及CPK、LDH 活性的影响（， n=10）

注：与假手术组比较，∗P＜0.05；与缺血再灌注组比较，#P＜0.05；—表示无

组别 剂量／（mg·kg-1）心肌梗死面积／% CPK／（U·mL-1）LDH／（U·mL-1）假手术组 — 4.45±0.82 93.38±12.95 168.03±18.54缺血再灌注组 — 20.08±4.60∗ 131.35±17.56∗ 293.24±36.52∗尼莫地平组 21.6 9.63±2.27# 106.63±14.32# 196.62±24.29#远志皂苷高剂量组 80 12.89±2.84# 110.27±13.68# 212.43±23.60#远志皂苷低剂量组 40 16.26±3.61# 117.10±12.45# 240.85±31.36#

3.3 远志皂苷对 TNF-α、IL-6、iNOS 水平的影响 表3显示，与假手术组比较，缺血再灌注组 TNF-α、IL-6、iNOS水平显著升高（P＜0.05）；与缺血再灌注组比较，尼莫地平组、远志皂苷组三者水平显著降低（P＜0.05）。

表3 远志皂苷对 TNF-α、IL-6、iNOS 水平的影响（， n=10）

表3 远志皂苷对 TNF-α、IL-6、iNOS 水平的影响（， n=10）

注：与假手术组比较，∗P＜0.05；与缺血再灌注组比较，#P＜0.05；—表示无

组别 剂量／（mg·kg）TNF-α／（pg·mL）IL-6／（pg·mL）iNOS／（pg·mL-1）-1-1-1假手术组 — 18.23±2.47 26.92±4.59 9.71±2.51缺血再灌注组 — 310.30±40.92∗ 771.60±85.23∗ 74.63±10.22∗尼莫地平组 21.6 88.24±13.10# 153.89±19.42# 14.26±2.43#远志皂苷高剂量组 80 123.97±15.71# 204.78±25.56# 26.62±3.91#远志皂苷低剂量组 40 181.06±21.48# 385.62±42.55# 33.23±5.39#

3.4 远志皂苷对 HMGB1 表达的影响 表4、图1显示，与假手术组比较，缺血再灌注组HMGB1 表达显著升高（P＜0.05）；与缺血再灌注组比较，尼莫地平组、远志皂苷组其表达显著降低，（P＜0.05），并呈剂量依赖性。

表4 远志皂苷对HMGB1 表达的影响（， n=10）

表4 远志皂苷对HMGB1 表达的影响（， n=10）

注：与假手术组比较，∗P＜0.05；与缺血再灌注组比较，#P＜0.05

组别 剂量／（mg·kg-1）HMGB1／GAPDH假手术组 — 0.23±0.04缺血再灌注组 — 0.81±0.07∗尼莫地平组 21.6 0.32±0.05#远志皂苷高剂量组 80 0.44±0.06#远志皂苷低剂量组 40 0.57±0.06#

图1 各组大鼠HMGB1 表达

4 讨论

心肌缺血再灌注损伤可引起心脏功能障碍、心肌梗死面积扩大、生化代谢指标异常等［12］现象。本实验采用手术结扎冠状动脉复制大鼠心肌缺血再灌注模型，发现与假手术组比较，缺血再灌注组大鼠缺血30 min、再灌注180 min后，LVEDP 升高、LVSP 降低，同时心肌梗死面积及血清CPK、LDH 活性均明显增加，表明建模成功；远志皂苷组LVEDP 升高，LVSP 降低，同时心肌梗死面积，血清 CPK、LDH 活性明显减少，表明该成分对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有一定保护作用，与郑璐、郭健龙等报道一致［10-11］。

炎症因子释放与心肌缺血再灌注损伤的发生发展关系密切［13］，心肌缺血再灌注后，TNF-α、IL-6 等大量炎症因子释放入血，使中性粒细胞与内皮细胞发生黏附，导致再灌注后无复流现象，反馈性地生成大量氧自由基，最终引起缺血再灌注损伤［14］。iNOS 在正常生理状态下活性较低，而当心肌发生缺血再灌注时，包括TNF-α、IL-6 在内的多种炎症因子表达上调，从而促使巨噬细胞内分泌大量iNOS，最终引起或加剧心肌缺血再灌注损伤程度［15］。本实验发现，远志皂苷预处理能通过降低心肌缺血再灌注损伤大鼠血清TNF-α、IL-6、iNOS 水平来减轻心肌缺血再灌注损伤，表明该成分对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护可能与减少炎症反应的发生有关。

机体从巨噬细胞、凋亡细胞或坏死细胞中释放HMGB1后，可作为早期炎症反应促进因子来上调 TNF-α、IL-6、iNOS 等炎症因子的表达，它们与心肌缺血再灌注损伤的发生密切相关［16］。研究表明，丹参酮ⅡA 预处理可通过抑制心肌缺血再灌注来引起ROS 增加，从而降低HMGB1 表达，减少炎症反应发生，最终起到对心肌缺血再灌注损伤的保护作用［17］。本实验发现，与丹参酮ⅡA 作用机制类似，远志皂苷组HMGB1 表达也明显降低，表明该成分也可通过抑制HMGB1 表达发挥相应的保护作用。

综上所述，远志皂苷具有保护大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用，其机制可能与减少炎症反应、抑制HMGB1 表达有关。