两种商品化培养液对胚胎体外发育和临床结局的影响比较

潘承双 徐芝慧 张欢 李燕 金建远 费前进 倪吴花

随着辅助生殖技术的发展，商品化培养液逐渐替代了实验室自制的培养液。相比实验室自制培养液，商品化培养液批次之间更稳定、使用更方便，也更有利于实验室质量控制[1]。现如今很多商品化培养液开始用于拾卵、精子洗涤、体外受精、胚胎发育、胚胎冷冻等各个环节[2]。但是不同厂家的培养液成分各不相同[3]，因此有可能造成胚胎发育的差异。目前尚无定论哪种商品化培养液最适合胚胎的培养[4]。本研究对比分析了Cook培养液和Vitrolife培养液对胚胎体外发育和临床结局的影响，探讨这两种培养液究竟哪种更适合胚胎体外发育。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2014年3至8月在本中心行常规体外受精-胚胎移植（IVF-ET）893例和卵胞浆内单精子注射-胚胎移植（ICSI-ET）320例新鲜周期的临床数据。入组标准：因女方输卵管因素、男方少弱畸精子症、梗阻型无精子症及其他因素在本中心接受IVF/ICSI-ET助孕治疗的患者。所有入选周期排除了女性子宫因素（如子宫肌瘤、子宫内膜异位症等）及其他疾病因素（如卵巢储备功能下降、染色体臂间倒位、多囊卵巢综合征等）。根据使用的培养液不同，IVF-ET周期分为Cook组456例和Vitrolife组437例，ICSI-ET周期分为Cook组143例和Vitrolife组177例。

1.2 方法

1.2.1 超排卵方案 采用黄体期长方案和短方案进行[5] 。

1.2.1.1 黄体期长方案 即促性腺激素（Gn）治疗周期的前一个月经周期的黄体中期肌肉注射0.5～0.9mg促性腺激素释放激素（GnRH）激动剂（醋酸曲普瑞林针，3.75mg/支，法国益普生制药公司），14d后达到降调标准，即子宫内膜≤5mm或血清雌二醇（E2）≤50pg/L，血清黄体生成激素（LH）水平≤5mIU/ml，开始使用促性腺激素针（基因重组卵泡刺激素，75IU/支，瑞士雪兰诺公司）。

1.2.1.2 短方案 于月经周期第2天开始，皮下注射短效GnRH激动剂0.1mg/d（醋酸曲普瑞林针，0.1mg/支，瑞士辉瑞制药有限公司），从月经第3天开始使用促性腺激素Gn针（基因重组卵泡刺激素，75IU/支，瑞士雪兰诺公司）。

上述两种方案，用Gn 150U/d或225U/d连续5d后，根据卵泡生长和血清E2水平调整用量，当B超监测到至少3个优势卵泡直径≥17mm时，当晚肌肉注射重组人绒毛膜促性腺素 250μg（250μg/支，瑞士雪兰诺公司），34～36h后取卵。

1.2.2 精液处理 精液液化后，行IVF的精液经非连续密度梯度离心法处理后，在G-IVF Plus（Vitrolife组）或K-SIFM（Cook组）受精液中上游1h后备用；行ICSI的精液经 G-MOPS Plus（Vitrolife组）或 K-SIGB（Cook组）直接离心后备用。受精前按照WHO标准[6]，分别检测精液的量、浓度和活动率。

1.2.3 IVF/ICSI 取卵后，根据临床指征行IVF或ICSI。IVF受精：分别将卵子和精子加入到G-IVF Plus（Vitrolife组）或K-SIFM（Cook组）培养液滴中进行受精。ICSI受精：卵子经过透明质酸酶（100IU/ml，美国Sigma公司）剥除颗粒细胞后，转移至G-MOPS Plus（Vitrolife组）或K-SIGB（Cook组）培养液滴中行ICSI。受精后16～18h，胚胎转移至 G1 Plus（Vitrolife组）或 K-SICM（Cook组）培养液中培养，显微镜下观察受精情况，见到双原核和双极体为正常受精。

1.2.4 胚胎质量评估 成功受精胚胎体外培养至第3天，根据本中心临床操作实际经验，对胚胎进行评分。优质胚胎评价标准[7]为：正常受精发育而来的胚胎，卵裂球数目7～9个，碎片≤15%，卵裂球无明显大小差异，定义为Ⅰ级胚胎；可移植胚胎的标准为：卵母细胞正常受精后第3天形成4细胞Ⅱ级以上的胚胎。其余胚胎继续培养至囊胚期，行冷冻保存。

1.2.5 胚胎移植和妊娠检查 选择评分最高的2～3枚胚胎进行移植，剩余胚胎进行囊胚培养，以移植后4周阴道B超下出现孕囊和胎心为临床妊娠[8]。

1.2.6 观察指标 患者一般情况（年龄、不孕年限、BMI、原发不孕率），获卵个数，正常受精率，卵裂率，第3天优质胚胎率，ET个数，种植率，妊娠率等。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用Wilcoxon符号秩和检验；计数资料组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较 IVF-ET周期中Cook组和Vitrolife组年龄、不孕年限、BMI和原发不孕率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。ICSI-ET周期中Cook组和Vitrolife组年龄、不孕年限、BMI和原发不孕率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

表1 IVF-ET周期中Cook组和Vitrolife组一般资料比较

表2 ICSI-ET周期中Cook组和Vitrolife组一般资料比较

2.2 IVF-ET周期中Cook与Vitrolife培养液对胚胎体外发育和临床结局的影响 IVF-ET周期中Cook组和Vitrolife组获卵个数、正常受精率、卵裂率、ET个数、种植率、妊娠率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），但Vitrolife组第3天优质胚胎率明显高于Cook组，差 异有统计学意义（P＜0.01），见表3。

表3 IVF-ET周期中Cook与Vitrolife培养液对胚胎体外发育和临床结局的影响

2.3 ICSI-ET周期中Cook与Vitrolife培养液对胚胎体外发育和临床结局的影响 ICSI-ET周期中Cook组和Vitrolife组获卵个数、正常受精率、卵裂率、ET个数、种植率、妊娠率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），但Vitrolife组第3天优质胚胎率明显高于Cook组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表4。

表4 ICSI-ET周期中Cook与Vitrolife培养液对胚胎体外发育和临床结局的影响

3 讨论

本研究比较了Cook培养液和Vitrolife培养液对胚胎体外发育和临床结局的影响，结果证实无论是IVFET周期还是ICSI-ET周期，Cook组和Vitrolife组获卵个数、正常受精率、卵裂率、ET个数、种植率、妊娠率比较差异均无统计学意义，但Vitrolife组第3天优质胚胎率均明显高于Cook组，差异均有统计学意义。

对于哪种商品化培养液更加有利于胚胎体外发育，学术界至今仍有争议。近年来，一些研究开始探讨不同培养液对体外受精临床结果的影响。Mauri等[9]比较了P1培养液和IVF-50培养液对ICSI周期胚胎发育以及临床结局的影响，发现两者之间受精率、卵裂率、种植率、临床妊娠率比较差异均无统计学意义。Ben-Yosef等[10]比较了Cook培养液和P1培养液，发现两者之间受精率、形态学评分比较差异均无统计学意义，但P1组临床妊娠率和种植率要优于Cook组。而Zollner等[11]分析比较了Vitrolife培养液和MediCult培养液，发现两者之间受精率、卵裂率、种植率、临床妊娠率比较差异均无统计学意义，这与本研究结果类似。蒋益群等[12]分析比较了Vitrolife培养液和Cook培养液，认为两者对妊娠结局并无明显影响，但Cook培养液可能更有利于囊胚阶段的发育。Wunder等[13]研究比较了Vitrolife培养液和 Cook培养液，认为两种培养液在初生儿体重影响上无差异。

目前，笔者尚不清楚为何Vitrolife组第3天优质胚胎率要明显高于Cook组。笔者推测这可能是由于两组培养液组成成分不一样，因而造成胚胎发育差异。Cook培养液与Vitrolife培养液大部分成分比较相似，但部分成分存在差异，其中两者之间乳酸浓度以及乳酸∶丙酮酸比值存在很大差别。Vitrolife培养液中乳酸盐浓度为10.8mM，高于Cook培养液的1.8mM；Vitrolife培养液中乳酸∶丙酮酸比值为36，高于Cook培养液的5[3]。乳酸和丙酮酸均可作为早期胚胎发育的能源物质，不同的是丙酮酸可以直接进入柠檬酸循环，而乳酸必须先通过乳酸脱氢酶作用转化为丙酮酸方可进入柠檬酸循环[14]。乳酸转化为丙酮酸的过程中会涉及氧化态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的消耗以及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的产生。而NAD+和NADH在维持细胞内代谢和氧化还原状态方面起着重要作用[15-16]，因此不仅仅是乳酸和丙酮酸的浓度影响胚胎的发育，乳酸∶丙酮酸比值同样影响胚胎的潜能。鼠胚研究证实细胞内的高乳酸∶丙酮酸比值会降低丙酮酸在细胞内的氧化作用[17]，进而造成细胞内氧浓度不同。而氧浓度不同则会造成丙酮酸吸收的差异[18]，最终又会影响胚胎体外发育。此外，Cook培养液与Vitrolife培养液中存在其他成分的差异：Vitrolife培养液中添加了0.08mm的柠檬酸盐，对应Cook培养液则为0；Cook培养液中添加了81μm的天冬氨酸盐，对应Vitrolife培养液为0[3]。培养液中这些成分的差异，很可能通过影响胚胎在培养液中代谢，最终导致胚胎发育的差异。

虽然Vitrolife组第3天优质胚胎率明显高于Cook组，但两种培养液对种植率和妊娠率均没有影响。笔者认为可能由以下原因造成：首先，ET时只挑选2～3枚胚胎移植，虽然Cook组第3天优质胚胎率低于Vitrolife组，但仍旧可以提供足够优质胚胎进行移植；其次，有文献报道第3天形态学评分并不能完全反映胚胎的种植潜能[19]。

本研究显示Vitrolife组第3天优质胚胎率明显高于Cook组，但两种培养液对种植率和妊娠率均没有影响。因此，暂时很难下结论Vitrolife培养液是否优于Cook培养液。下一步研究笔者考虑扩大样本量以及延长培养时至第6天，比较两组囊胚形成率是否存在差异，同时进行随访分析比较两组出生胎儿的体重、性别比例等指标是否有统计学差异。这将有助于进一步了解和比较Cook培养液和Vitrolife培养液对胚胎体外培养的影响。