木薯苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及其对低温胁迫的响应

吴远航 刘秦 刘攀道 郭鹏飞 李敏 蒋凌雁

摘  要  本研究从全基因组水平对木薯（Manihot esculenta Crantz）苯丙氨酸解氨酶编码基因（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）进行鉴定，并以木薯品种KU50为材料克隆了6个PAL基因，分析了低温胁迫（7 ℃）对叶片MePAL表达模式、PAL酶活性、总酚含量、类黄酮含量和总抗氧化能力的影响。结果表明：低温处理使木薯叶片迅速萎蔫卷曲，并伴随叶片PAL酶活性、总酚含量、类黄酮含量和总抗氧化能力的显著提高。Real-time PCR分析表明，在低温处理前，MePAL1和MePAL2的相对表达量分别为0.83和1.19，显著高于其他4个MePAL基因，低温处理后6个MePAL基因均不同程度受低温胁迫诱导增强表达，其中MePAL5上调最高，达50.5～142.5倍。本研究结果初步显示低温胁迫上调了木薯叶片MePAL的表达，促进了总酚和类黄酮的合成，提高了抗氧化损伤的能力。

关键词  木薯;低温胁迫;苯丙氨酸解氨酶基因;类黄酮;抗氧化

中图分类号  S533     文献标识码  A

木薯（Manihot esculenta Crantz）作为一种主要收获块根的经济作物，是热带地区重要的粮食来源和生物能源原材料[1]。木薯抗旱、耐瘠薄、适应性强，在我国南方被大量种植。但木薯是典型的热带作物，低温是限制其种植区域和产量的重要因素[2]。在低温环境下，木薯细胞膜结构破坏，胞内电解质外渗，毒性物质积累，活性氧产生，叶片光合作用受阻，植株生长发育延缓，甚至死亡。

苯丙烷代谢途径是植物缓解逆境胁迫的一条重要次生代谢途径[3-4]。该途径以L-苯丙氨酸或者酪氨酸为底物，通过系列酶促反应，可产生大量的苯丙烷类化合物，包括多酚、香豆素、类黄酮/花青素和大分子木质素等多种化合物[5-6]。研究表明酚类、类黄酮等物质可以作为抗氧化剂，清除逆境胁迫下产生的大量活性氧和自由基，从而降低逆境胁迫下植物所受的氧化损伤[7]。低温逆境下，玉米可以通过调节花青素合成通路的相关基因，提高花青素的含量，增强对低温的耐受[8]。大豆在低温驯化过程中，多种苯丙烷代谢产物（对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、茴香酸、对香豆酸和阿魏酸）的相对含量显著提高，这些酚酸被认为可改变细胞壁的物理特性，提高大豆对低温的适应能力[9]。宋静武等[10]研究了低温胁迫下核桃（Juglans regia）叶片多酚黄酮类成分，发现这类物质的含量与低温胁迫响应有较强的相关性。董春娟等[11]研究了黄瓜（Citrullus lanatus）幼苗的抗寒性，发现苯丙烷类次生代谢产物合成的增多可以提高细胞内抗氧化酶的活性，保持抗坏血酸（AsA）的还原性，缓解低温胁迫以及叶片的光损伤和氧化损伤。

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase， PAL）催化L-苯丙氨酸形成肉桂酸，是苯丙烷代谢途径的关键酶和限速酶[12]。其活性同植物体内酚类、类黄酮等各种次生代谢产物的合成有着密切关系[13]。PAL在转录水平上受到多种胁迫信号的调节，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片中的AtPAL1和AtPAL2在低温条件下表达上调[14]。植物遭受机械伤害、干旱、高温等逆境胁迫研究时，均可检测到部分PAL的上调表达[15-17]。作為已完成基因组测序的重要热带农作物，木薯PAL信息知之甚少。本文研究了低温胁迫下MePAL的表达模式、PAL酶活性、类黄酮含量、总酚含量和总抗氧化能力的变化，旨在解析MePAL介导的苯丙烷代谢途径对低温胁迫的响应模式，为木薯耐低温品种选育和栽培提供理论基础。

1  材料与方法

1.1  材料

供试木薯品种为KU50（Kasetsart University 50），种茎来源于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，盆栽于海南大学热带农林学院实验基地。

1.2  材料的低温胁迫处理

盆栽45 d后，选取健康、长势基本一致的木薯苗，置人工气候培养箱，在温度25 ℃，光培养16 h，暗培养8 h的条件下“均一化”处理3天。然后降温至7 ℃进行胁迫处理，在0、9、24 h取木薯苗的第一片和第二片完全展开的功能叶（从上往下数），每个时间点设3个生物学重复，取样后放入液氮中速冻，贮存于80 ℃超低温冰箱中备用。

1.3  相关生理指标的测定

1.3.1  PAL活力测定   测定原理：PAL催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸和氨，反式肉桂酸在290 nm处有最大吸收值，通过测定吸光值变化计算PAL活性。具体步骤参照苯丙氨酸解氨酶（PAL）测试盒（购于南京建成生物工程研究所，货号：A137）的说明书。

1.3.2  类黄酮（Flavonoid）含量测定  测定原理：在碱性亚硝酸盐溶液中，类黄酮与铝离子形成在502 nm处有特征吸收峰的红色络合物，通过测定样品提取液在502 nm处的吸光值计算类黄酮的含量。具体步骤参照植物类黄酮检测试剂盒（购于南京建成生物工程研究所，货号：A142）的说明书。

1.3.3  总酚（Total phenol）含量测定  具体步骤参照植物总酚检测试剂盒（购于南京建成生物工程研究所，货号：A143）的说明书。

1.3.4  总抗氧化能力（T-AOC）测定  测定原理：机体中有很多抗氧化物质，能使Fe3+还原成Fe2+，后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物，该络合物在520 nm处特征吸收峰，通过测定520 nm处的吸光值可以计算出抗氧化能力。具体步骤参照总抗氧化能力测定试剂盒（购于南京建成生物工程研究所，货号：A015）的说明书。

1.4  RNA提取及cDNA合成

称取叶片样品0.1 g，用液氮研磨成粉末，按照RNAplant Plus植物总RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）的说明书，提取木薯总RNA，使用超微量分光光度计NanoDrop 2000检测总RNA的浓度和纯度。参照Primescript RT Reagent Kit gDNA Eraser反转录试剂盒（TaKaRa）的说明书合成cDNA，保存于20 ℃。

1.5  生物信息学分析

利用木薯基因组数据库（http：//www. phytozo

me.net/cassava）获得木薯PAL的所有序列;利用Protparam在线工具（https：//web.expasy.org/ protp

aram/）进行蛋白理化性质分析;利用GSDS在线工具（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）进行基因结构分析;利用MEGA 7软件建立系统进化树。

1.6  基因的克隆及Real-time PCR分析

利用Oligo 7软件设计基因全长引物及定量

引物（表1），并由天一辉远基因科技有限公司合成。利用全长引物，以上述合成的cDNA为模板，使用高保真聚合酶Phusion（Thermo）扩增MePAL的全長序列。

以木薯内参基因ef1α为参照[18]，使用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术分析基因的相对表达量。试剂盒为SYBR? Premix Ex Taq? II （Tli RNaseH Plus），购于TaKaRa公司。使用的仪器为Rotor-Gene Q（QIAGEN），采用双标准曲线法计算相对表达量。

1.7  数据分析

本研究的相关数据有3次生物学重复，使用 Microsoft office 2007软件进行分析并绘制图表，使用IBM SPSS Statistics 20软件进行独立样本T检验来分析差异的显著性。

2  结果与分析

2.1  MePAL的生物信息学分析

在木薯基因组数据库中用BLAST搜索4个拟南芥PAL的同源氨基酸序列，获得6个木薯PAL及其候选基因（MePAL），按所在染色体上的顺序对其依次命名为MePAL1-MePAL6。6个MePAL分别分布在木薯的4、7、8、9、10和16号染色体上;6个推测的PAL蛋白的等电点介于5.90～

6.31 pI之间，均为酸性蛋白;分子量介于76.97～ 78.16 ku之间（表2）。

为了比较木薯PAL之间的相似性，将推测的6个木薯PAL的氨基酸序列进行对比（图1A）;并利用MEGA 7软件使用Neighbor-Joining算法，bootstrap值为1000，对氨基酸序列绘制了进化树（图1B）;同时利用GSDS在线工具绘制了基因结构图（图1C）。从进化树来看，MePAL2与MePAL5，MePAL3与MePAL4之间的同源性较高，MePAL6与其他5个MePAL同源性较低，被分在2个不同的分支;从基因结构来看，MePAL1-5都有2个外显子和1个内含子，而MePAL6与MePAL1-5不同，只有1个外显子，没有内含子。

2.2  MePAL编码基因的克隆

根据6个MePAL基因的序列，设计全长引物（表1），以cDNA为模板，进行RT-PCR反应，扩增得到6条2100 bp左右的片段，与目标大小一致，如图2所示。

2.4  低温胁迫下木薯叶片PAL活性、总酚含量、类黄酮含量和总抗氧化能力变化

由图4所示，低温处理使木薯叶片PAL酶活性显著增加，7 ℃处理9 h和24 h后木薯叶片PAL酶活性分别为处理前（0 h）的1.68倍和1.72倍。低温处理还导致木薯叶片的总酚含量和类黄酮含量分别提高47.66%～55.75 %和41.97%～50.65 %，同时，总抗氧化能力也提高了1.03～2.82倍。

2.5  MePALs受低温胁迫诱导

在低温胁迫下的表达模式，结果表明，低温处理9 h和24 h使MePAL3、MePAL4、MePAL5和MePAL6的表达水平显著提高，其中，MePAL5上调倍数最多，在低温处理9 h和24 h后的表达量分别为处理前（0 h）的142.5倍和50.5倍。此外，虽然MePAL1的表达量在低温处理9 h后无显著增加，但处理24 h后上调。而MePAL2仅在低温处理9 h后显著上调表达。

3  讨论

总酚和类黄酮是植物中重要的次生代谢物质，同植物的逆境响应有着密切的关系。Pennycooke等[19]发现低温处理矮牵牛花（Petunia hybrida）提高了总酚含量和总抗氧化能力。此外对拟南芥的研究发现，在低温，干旱，高盐条件下，类黄酮合成被促进[20]。本研究中，木薯在低温胁迫处理9 h和24 h后，叶片的总酚含量与类黄酮含量相对于0 h均显著提高，总抗氧化能力也显著提高，暗示总酚和类黄酮参与了木薯对低温冷害的响应。这些物质可以作为一类供氢型自由基清除剂[21]，来降低活性氧和自由基对植物的伤害。PAL作为苯丙烷代谢途径的第一个酶，其活性同植物体内多酚和类黄酮的总含量呈正相 关，因此PAL活性可以作为植物抗逆境能力的一个生理指标[22]。低温处理后，木薯的PAL活性得到显著提高，暗示PAL可能通过调节多酚和类黄酮合成，进而参与木薯对低温胁迫的响应。

随着大量的植物基因组序列公布，多种植物的PAL编码基因家族已被鉴定，在所有已研究的物种上，PAL被证明是一个多拷贝基因家族。虽然这些PAL基因序列的编码区在不同物种中差异较小，但是家族基因数量变化较大，如拟南芥中只有4个PAL基因[23]，西瓜（Citrullus lanatus）中有12个PAL基因[24]，而马铃薯（Solanum tuberosum）中则至少有40个PAL基因[25]。本研究从全基因组水平对木薯PAL编码基因进行了生物信息学分析，共鉴定并克隆了6个MePAL。进化树结果分析表明，MePAL2和MePAL5，MePAL3和MePAL4互为旁系同源基因，表明在木薯PAL基因在进化过程中经历过基因复制事件。木薯的PAL基因多为2个外显子，1个内含子结构，这与已报道的其它物种的PAL基因结构较为一致。但MePAL6只有一个外显子，表明该基因在进化过程中丢失了内含子。

PAL基因的表达除了受组织特异性和发育时期的影响之外，还受不同环境条件的调控。对黄瓜的研究表明，低温诱导了幼苗中PAL基因的表达，并显著提高其酶活性[11]。类似地，红叶芥（Brassica Juncea）PAL的基因表达水平和酶活性在低温胁迫18 h后迅速升高[26]。本研究中，低温胁迫使木薯叶片6个MePAL的转录水平发生不同程度的上调，同时使PAL酶活性显著增加，表明MePAL基因转录水平的上调与PAL酶活性升高有关。旁系同源基因MePAL2与MePAL5，MePAL3与MePAL4在表达量高低、变化趋势上的表现较为一致，暗示它们在受低温胁迫时可能存在功能协同，与拟南芥、西瓜、黄瓜、葡萄（Vitis vinifera）和番茄（Lycopersicon esculentum）等的情况相似[27-28]。

综上所述，木薯在低温胁迫下通过上调叶片MePAL基因的表达水平和PAL酶活性，促进苯丙烷代谢途径下游代谢产物（总酚和类黄酮）的合成，从而提高木薯叶片总抗氧化能力和低温逆境的适应性。

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