虫白蜡治疗雄激素性脱发的作用机理研究

1.中国林业科学院资源昆虫研究所，云南 昆明 650233；2.玉溪师范学院化学生物与环境学院，云南 玉溪 653100

脱发已经成为一个世界性的难题，它严重影响患者的自尊心。脱发药物的研究与开发成为当今研究热点。文献报道延长毛囊生长期能有效的阻止毛发的脱落[1]。提高毛囊营养供应和阻止毛囊由生长期进入退休期是阻止毛发生长的有效措施之一,由皮乳头细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)是毛囊营养的主要来源[2]。VEGF通过促进毛细血管的形成，调控与毛球相连的毛细血管的数量，为毛囊的生长提供营养。存在于毛囊的内根鞘的表皮生长因子。具有调节角质细胞的增殖和分化，促进外根鞘细胞的生长，控制毛囊生长期的长短的作用[3-5]。毛囊的生长周期分为生长期、退行期和休止期，不同生长阶段毛囊的形态和毛囊内碱性磷酸酶的表达量不同。生长期，毛囊逐渐由表皮层延伸到真皮层，毛囊柄逐渐延长，毛球膨大呈圆形，毛囊结构完整(即在毛囊横切面能明显看到毛干、内根鞘、外根鞘和芥蒂组织)。退行期，毛囊从真皮层逐渐萎缩上升到表皮层，毛囊柄萎缩变短，毛球呈钉型，毛囊的内根鞘结构紊乱，看不到毛囊内根鞘[6]。休止期，毛囊柄继续缩短，位于皮肤的表皮层。由于毛囊循环具有不可逆性，因此，生长期毛囊数量和退行期毛囊数量的比值是评价毛囊生长状态重要的指标之一[7]。碱性磷酸酶是存在于毛囊内的有一种锌指酶，其表达量的高低反应了毛囊所处的生长阶段。碱性磷酸酶表达量在毛囊生长期的初级阶段最高，随后逐渐降低直至退行期。毛囊进入下一个循环后，碱性磷酸酶表达量也随之发生升降变化[8]。由此可知，生长期与休止期毛囊数量的比值(A/T)可用于评价毛发的生长状况。碱性磷酸酶在皮肤内表达量反应毛囊的生长阶段。提高血管内皮生长因子和表皮生长因子的表达量，可延长毛囊的生长期，阻止毛发脱落。

虫白蜡是半翅目Hemiptera蚧总科Coccoidea虫白蜡蚧属Ericerus的虫白蜡虫雄性幼虫在寄主植物枝条上分泌的次生代谢物质，其主要成分为碳原子数在48～64范围内蜡酯，含量为93%～95%[9]，是我国特有的一种昆虫药。早在《本草纲目》收录的《集玄方》中记载“头上秃疮，蜡烛频涂，勿令日晒，久则生发”，表明虫白蜡对真菌感染引起的脱发具有一定的作用效果。笔者研究发现虫白蜡能明显促进脂溢性脱发模型小鼠毛发的生长，但对其治疗脂溢性脱发的机理尚不清楚。本文以脂溢性脱发小鼠为模式动物，通过检测虫白蜡对毛发重量、不同时期毛囊数量、表皮生长因子、血管内皮生长因子和碱性磷酸酶的表达量，探究虫白蜡对毛囊生长期的调节作用，为虫白蜡产品的开发和应用奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验药物 虫白蜡：购自于四川峨眉虫白蜡研究所；米诺地尔酊剂(曼迪)：购自浙江万晟药业有限公司，含量为5%，批号：160103。丙酸睾酮购自杭州动物药品厂，生产批号：150813，丙酸睾酮溶解到灭菌大豆油中，配置成浓度为5 mg/mL的溶液；碱性磷酸酶试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20160618；血管内皮生长因子试剂盒和表皮细胞生长因子试剂盒：上海依科赛生物制品有限公司，批号分别为21F120和21E254；一步法动物组织活性蛋白提取试剂盒：生工生物工程股份有限公司，批号：C325DA0008。

1.2 试验动物 试验动物：KM小鼠购自于北京华阜康生物科技股份有限公司，SPF级，5周龄雄鼠，批准文号：11401300042992，在室内适应性饲养1周，饲养温度为室温，光照L∶D=12 h∶12 h，饲喂人工饲料，食物和水不限量供应。

1.3 仪器 倒置显微镜：型号VHX-1000，基恩，日本，石蜡切片机：型号RM2126RT，上海徕卡仪器有限公司。多功能酶标仪：型号3001-1592，赛默飞世尔科技，气相色谱：型号HP1890，惠普上海分析仪器有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 试验动物分组与处理 将150只KM小鼠随机分成6组，设CK组(不做任何处理)、模式组(皮下注射丙酸睾酮)、阳性对照组(皮下注射丙酸睾酮+局部涂抹2%非那雄胺)、实验组(皮下注射丙酸睾酮的同时局部分别涂抹5%、10%和15%虫白蜡)，每组25只试验动物，动物模型的建立参照Renuka等[10]的报道，每天在小鼠背部皮下注射0.1 mL丙酸睾酮，连续注射60 d。皮下给药的同时，除模式组外，其他组每天在小鼠背部局部涂抹0.5 mL相应的药液。

1.4.2 毛囊生长期/休止期(A/T) 给药第7(只称取毛发重量)、14、21、28、45、60天每组随机选取5只小鼠，用乙醚迷晕后脱颈处死，剪下小鼠背部面积为2 cm×3 cm的毛发及皮肤，剪下的毛发直接称量其重量，皮肤在4%多聚甲醛中固定12 h，流水冲4 h，在不同浓度的乙醇中(30%、50%、70%、85%、90%、95%、无水乙醇、二甲苯)脱水、浸蜡、装盒，横切蜡块，烤箱58～60 ℃过夜，H&E染色。记录1 mm皮肤范围内生长期(A)和休止期(T)毛囊的数量，计算生长期与休止期的比值(A/T)。生长期判断标准为具有完整的毛囊结构，即具有内根鞘、外根鞘；休止期判断标准为毛囊没有内根鞘[6]。

1.4.3 碱性磷酸酶活性测定 取给药第14、21、28、45、60天小鼠背部皮肤，剪碎，称重，加入4倍量0.1M的磷酸缓冲盐(pH值为7.4) ，在玻璃均浆器中匀浆，12000 rpm，4 ℃离心20 min，取上清液，分装放在-70 ℃条件下保存。用碱性磷酸酶试剂盒测定皮肤内碱性磷酸酶(ALP)的含量，操作步骤按照试剂盒说明进行。在96孔板内添加适量的样品和试剂，37 ℃孵育15 min，加入显色剂，摇匀，用酶标仪在520 nm波长时测定每孔的吸光度值。采用考马斯亮测定样品中蛋白质的含量，每个样品3次重复。按照下列公式计算样品中ALP的活性：皮肤内ALP活性=(测定OD-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)×酚标准品浓度/待测样本蛋白浓度。

1.4.4 生长因子测定 试验第28天，每组随机选取5只小鼠，取小鼠背部皮肤，剪碎，称重，按一步法动物组织活性蛋白提取试剂盒操作说明进行。加入9倍量的组织提取液，在冰上孵育20 min，4 ℃离心，取上清液，采用试剂盒测定皮肤内血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子(EGF)，操作步骤按照试剂盒说明进行。用酶标仪在450 nm波长时测定样品中血管内皮生长因子的吸光度值，在560 nm波长时测定样品中表皮生长因子的吸光度值。采用考马斯亮测定样品中蛋白质的含量。每个样品3次重复。根据标准曲线计算出每个样品的浓度除于样品蛋白质浓度。

2 试验结果

2.1 毛发重量 给药60 d，虫白蜡和阳性对照组小鼠背毛生长情况明显优于模式组。虫白蜡组背毛有光泽，毛发生长浓密，模式组小鼠背部脱毛明显(如图1)。虫白蜡组单位面积内毛发的重量高于模式组。给药21 d，各组小鼠被毛重量达到峰值，随后毛发的重量降低，其中，CK组和10%虫白蜡组毛发重量在给药第28天时缓慢上升，15%虫白蜡组和阳性对照组在给药第45天时才开始上升。如图2所示。

2.2 毛囊A/T比值 小鼠毛囊A/T比值随着给药时间发生变化，虫白蜡组毛囊A/T变化趋势与阳性对照组相似，呈“N”字形，在给药第28天和45天，分别出现最高点和最低点，其值明显高于模式组。给药28 d时，10%虫白蜡A/T比值明显高于CK组、阳性对照和5%、10%虫白蜡组。给药60d时，除模式组外，各组A/T比值差异不显著。如图3所示。

2.3 碱性磷酸酶活性 皮下连续注射丙酸睾酮60 d，小鼠皮肤内ALP含量下降，其最高值出现的时间早于CK组，给予不同浓度的虫白蜡和米诺地尔后，ALP含量明显升高，且随着给药时间发生改变。其中，虫白蜡组ALP变化趋势与阳性对照组相似，即给药14～28 d，ALP呈上升状态，随后降低，给药45 d，ALP含量降到最低点后反弹；给药45～60 d，10%虫白蜡组ALP含量明显高于5%、15%虫白蜡和阳性对照组。如图4所示。

2.4 生长因子 给药第28天，虫白蜡组和阳性对照组小鼠皮肤内血管内皮生长因子和表皮生长的表达量明显高于模式组。随着虫白蜡浓度的增加，VEGF含量增加，虫白蜡用量高于10%时，VEGF含量与阳性对照组和CK组差异不显著。EGF的含量变化不随虫白蜡浓度的升高发生变化。10%虫白蜡组EGF的含量明显低于低于5%、15%虫白蜡组，其值与CK组差异无统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1不同处理小鼠皮肤内生长因子的表达量

处理血管内皮生长因子表皮生长因子CK42.51±5.151478.55±112.62∗模式36.78±2.81 765.85±35.845%米诺地尔66.53±10.77△2418.56±132.95∗5%虫白蜡39.32±4.131966.01±127.47∗10%虫白蜡55.94±7.541488.44±125.78∗15%虫白蜡63.64±4.40△2550.06±130.20∗

注：与模式组比较，*P<0.01，△P<0.05。

3 讨论

给药期间，虫白蜡组小鼠皮肤内ALP表达量、A/T、毛发重量随时间发生变化，出现峰值的时间早于CK组，而与阳性对照组相同，分别为28 d和45 d；给药28 d时，测定小鼠皮肤内VEGF和EGF表达量，结果显示，虫白蜡浓度为10%时VEGF的表达量最低，其值明显高于模式组，而与CK组差异不显著。表明，皮下注射丙酸睾酮后缩短了毛囊的周期，给予虫白蜡后能提高雄激素性脱发模型小鼠毛发营养的供应。

现代研究表明，延长毛囊的生长期，提高毛囊营养的供应可有效防治毛发的脱落[11]。ALP和A/T是评价毛囊处于生长期的关键性指标。VEGF和EGF是毛囊营养供应的关键指标[12-14]。毛囊具有循环再生的能力，其生长过程包括生长期、退行期和休止期。在生长期内毛囊细胞生长旺盛，毛囊柄伸入到真皮层，分泌较多的VEGF，为毛囊提供充足的营养，生成的毛干直径较粗，毛发较长；在退行期毛囊细胞开始凋亡，VEGF分泌量减少，毛干开始萎缩，其长度随着毛囊柄长度的缩短而减少，到休止期毛囊到达表皮层，细胞几乎不分泌VEGF，毛囊营养供应不足，毛发开始脱落。正常情况下，毛囊的三个生长阶段同时存在，共同维持新旧毛发的更替。当退行期和休止期毛囊数量增多时，会导致毛发的脱落。有效的促进VEGF的分泌，能延长毛囊的生长期，提高生长期毛囊的数量，阻止毛发的脱落，从而达到治疗脱发的目的。EGF是毛囊生长期与退行期转化的开关[5]。文献报道，表皮生长因子促进毛发生长的作用与其剂量关系密切，其表达量只有在2×103～2×104pg/mL范围内才能促进毛发的生长[5，15]。因此，控制EGF的表达量在适宜的范围也可有效的阻止毛发的脱落，达到治疗脱发的目的。

Lida[8]报道，ALP在毛囊生长期的初期表达量最高，随后其含量降低，一直持续到休止期，碱性磷酸酶在休止期内的含量最低。由此可知，除了A/T比值外，ALP含量变化也能反映毛囊生长期的变化。经过研究笔者发现，皮下注射丙酸睾酮后，小鼠皮肤内ALP的变化趋势与A/T比值相同，即ALP的表达量和A/T比值在28 d和45 d时出现高峰和低谷。测试范围内，CK组ALP和A/T比值一直处于平稳的的上升阶段。给予虫白蜡后，小鼠皮肤内ALP值出现的时间与模式组相同，但其表达量明显高于模式组。表明，皮下注射丙酸睾酮后，毛囊生长周期缩短，其生长初期和休止期分别始于给药后的28d和45d，给与虫白蜡后并不能改变毛囊的生长周期。

测定生长期表皮内小鼠的VEGF和EGF发现，10%虫白蜡VEGF和EGF表达量与CK组差异不显著，其值明显高于模式组。表明，虫白蜡通过提高毛囊内的血管内皮生长因子表达量，促进毛囊营养的供应，治疗脂溢性脱发。但10%虫白蜡组VEGF和EGF表达量与阳性对照组相比表现为不同的显著性，10%虫白蜡组VEGF表达量与阳性对照差异不显著，而其EGF表达量明显低于阳性对照组，这可能是导致虫白蜡组促进毛发生长的效果优于阳性对照组的原因。关于这一点还需进一步验证。