瑶山甜茶通过调节线粒体自噬改善糖尿病大鼠并发症的实验研究

郑 华1 魏秋梅1 孟春梅1 莫肖敏1 李卫东1 成晓静1 苏志恒2

1.广西医科大学生命科学研究院，广西 南宁 530021;2.广西医科大学药学院药物分析教研室,广西 南宁 530021

糖尿病是一组以高血糖和高血脂为特征的代谢性疾病，由此引发的心血管和微血管并发症成为致死、致残的主要原因。线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成能量的主要场所，调控细胞增殖与能量代谢。线粒体在氧化磷酸化产能过程中伴随着活性氧(ROS)的产生，线粒体损伤，糖尿病糖脂毒性直接或间接导致氧化磷酸化障碍，ROS增多，加重线粒体的损伤，促凋亡因子释放增多，细胞凋亡形成增多。为了维持细胞稳态，细胞通过选择性清除受损的线粒体，形成自噬体，降解其内容物，补充细胞能量，称为线粒体自噬。细胞大多通过线粒体途径凋亡，是单向性的，而线粒体自噬清除受损的线粒体，减少ROS，减轻线粒体外膜通透化，防止受损的线粒体释放细胞色素C等线粒体促凋亡蛋白从而抑制凋亡，维持细胞稳态，是双向性的。线粒体自噬与凋亡的合作、对抗亦或推动的关系成为当前的研究热点[1-2]。

广西瑶山甜茶(RubussuavissimusS.Lee)，为蔷薇科悬钩子属多年生有刺灌木，主要分布在广西壮族自治区金秀、藤县、苍梧等地，生长在海拔500～1000米处大瑶山山区，是广西壮族自治区民间壮、瑶族人民用于治疗糖尿病、肥胖症的民族常用药，疗效确切，被喻为瑶药中的“神茶”，在广西民间已有几百年的使用历史，也是通过了美国FDA认证的具有药、糖、茶三重功效的甜味植物。广西瑶山甜茶中不仅含有黄酮类、二萜及其苷类、甜茶素、甜茶多酚、鞣质等化学成分，而且含有多种维生素、氨基酸、微量元素，其中甜茶素是其最主要发挥药效的化学成分。有研究表明，瑶山甜茶对心血管病、 高血压、 动脉硬化，糖尿病肾病等糖尿病并发症也具有一定的疗效[3-4]，但具体的作用机制未明。本实验旨在初步探讨广西瑶山甜茶对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病模型大鼠血糖及各器官超微结构的改变，探讨其治疗糖尿病并发症的新靶点，为其进一步开发提供实验依据。

1 材料

1.1 药物与试剂 广西瑶山甜茶采自广西壮族自治区金秀县大瑶山，由广西药用植物研究所莫长明副研究员鉴定为蔷薇科悬钩子属广西甜茶。链脲佐菌素(纯度>98%,Sigma公司，批号:S0130)；盐酸二甲双胍(中美上海施贵宝有限公司，生产批号：AAB7135)。

1.2 仪器 Accu-Chek Performa型血糖仪(德国罗氏诊断有限公司)，TDL-33型台式低速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂)，H-7650透射电子显微镜(日本日立公司)。

1.3 实验动物 SPF级雄性SD大鼠60只，体重180～220 g，由广西医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK-(桂)2014-0002。

2 方法

2.1 广西甜茶提取液的制备 称取100 g 的广西瑶山甜茶叶，去除多余的枝干，晒干粉碎。添加10倍量的蒸馏水微沸提取两次，每次2 h，过滤，合并滤液，旋转真空浓缩滤液至50 mL左右，定容至100 mL，即得甜茶总水提取物浓缩液(浓度：1 g·mL-1)，放入-20 ℃冰箱冻存。

2.2 糖尿病大鼠模型的建立及分组 选取重量(200±20)g，雄性SD大鼠60只，动物在室温为20～24 ℃，相对湿度50%～70%的人工模拟自然昼夜环境条件下饲养，动物自由摄食饮水，经适应l周后开始实验。随机取10只大鼠作为正常组，其余大鼠造模。在大鼠禁食不禁水12 h后，将STZ溶于0.1 mol·L-1柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.2～4.5)，在避光条件下配制成浓度为1%的溶液，按STZ 55 mg·kg-1作单次腹腔注射，正常对照组注射相同体积的0.1 mol·L-1柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4.2～4.5)。72 h 后至少连续3 d尾静脉检测血糖。以连续3次测得血糖≥16.7 mmol·L-1为糖尿病模型大鼠。选取以上造模方法获得造模成功的糖尿病大鼠随机分为4组即模型组、甜茶高剂量组、甜茶低剂量组、阳性药组，每组6只。

2.3 给药方式 正常对照组与模型对照组每天给予相等容积生理盐水灌胃，阳性药二甲双胍组给予体质量200 mg·kg-1灌胃，瑶山甜茶高剂量治疗组、低剂量治疗组每天分别给予6 g·kg-1，3 g·kg-1体质量灌胃，连续6周。每天1次，每周根据体重调整用量。

2.4 各组大鼠空腹血糖值 分别于给药后第0周、第2周、第4周、第6周将小鼠禁食、不禁水12 h，称重，测定小鼠空腹血糖。

2.5 各组大鼠肝、心脏、肾脏脏器指数 将大鼠断头处死，取出肝、心脏、肾脏等器官，用生理盐水洗去血污，吸干水分，称重，计算肝脏、心脏及肾脏脏器指数。

2.6 各组大鼠心肌组织、肾组织、肝组织超微结构观察 取各组大鼠心肌组织、肾组织、肝组织各1 mm3，立即投入3%预冷的戊二醛固定液中固定2 h后，0.1 mol 磷酸盐缓冲液清洗3次，锇酸固定，0.1 mol磷酸盐缓冲液清洗3次，乙醇梯度脱水(50%、70%、80%、90%、100%)，乙醇丙酮1∶1(浓度为90%)脱水，100%丙酮脱水3次，用618包埋剂、DDSA、DBP、DMP-30调和剂渗透包埋，放入烘箱聚合(38 ℃ 12 h，45 ℃ 12 h，60 ℃ 48 h)，超薄切片，醋酸铀、枸橼酸铅分别染色5 min，日立H-7650透射电镜下观察。

3 结果

3.1 瑶山甜茶对各组大鼠空腹血糖值的影响 与正常组比较，模型组大鼠血糖在各个观察时间点均显著升高(P<0.01)；与模型组相比，阳性药组和甜茶提取物低剂量组从第2周就开始显著降低(P<0.01)，甜茶提取物高剂量组血糖在第6周显著降低(P<0.05)。见表1。

组别0周2周4周6周Control6.13±0.376.95±0.536.07±0.685.93±0.31Model28.25±3.49##27.55±2.463##29.73±2.23##27.50±6.65##Positive28.28±2.2615.23±5.966∗∗12.00±4.86∗∗15.17±5.13∗∗L-RS21.75±5.2320.65±8.11∗∗19.00±4.46∗∗15.17±5.13∗∗H-RS27.45±5.2326.40±3.4426.37±3.5920.87±4.04∗

注：与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01；与正常组比较，#P<0.05,##P<0.01。

3.3 瑶山甜茶提取物对各组大鼠脏器指数的影响 与正常组比较，模型组大鼠肝脏、心脏及肾脏指数均显著升高(P<0.01)；与模型组相比，甜茶高剂量组、低剂量组和阳性药组大鼠肝脏指数、心脏指数、肾脏指数均显著降低(P<0.05)。见表3。

组别肝脏指数心脏指数肾脏指数Control2.55±0.160.32±0.040.52±0.02 Model4.46±0.30##0.40±0.03##1.17±0.13##Positive2.80±0.17∗∗0.33±0.01∗∗0.66±0.07∗∗H-RS2.74±0.37∗∗0.34±0.44∗0.75±0.15∗∗L-RS3.52±0.70∗0.38±0.07∗0.88±0.25∗

注：与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01；与正常组比较，#P<0.05,##P<0.01 。

3.4 瑶山甜茶对各组大鼠心肌组织、肾组织、肝组织超微结构的影响 如图1(A-C)，模型组大鼠心肌细胞线粒体空泡化，线粒体嵴断裂，排列紊乱，心肌肌丝排列紊乱，Z线扭曲，糖原颗粒聚集，而甜茶提取物组大鼠心肌细胞线粒体排列整齐，线粒体空泡化程度减轻，肌丝排列整齐，出现双层膜的自噬小体，里面可见包含残缺的线粒体嵴等内容物，未见凋亡小体。

如图1(D-F)，模型组大鼠大部分肾小球基底膜明显增厚或厚薄不均，系膜基质增多，足细胞足突广泛融合,上皮细胞线粒体肿胀、结构紊乱，可见散在高电子密度沉积物，部分肾小管基底膜增厚，可见足细胞细胞核核染色质边集，呈细胞凋亡早期病变，而甜茶提取物组大鼠肾小球、肾小管基底膜局部增厚，系膜基质轻度增加，足突部分融合，部分区域可见完整的足突排列，上皮细胞和内皮细胞的线粒体改变较轻，部分细胞质出现双层膜的自噬小体，内包含少许线粒体嵴等内容物。

如图1(G-I)，模型组大鼠肝细胞核染色质边集，线粒体嵴消失、线粒体空泡化，内质网扩张严重，甜茶提取物组大鼠肝细胞线粒体肿胀程度减轻，凋亡减少，可见不同程度的自噬小体，包含破坏的线粒体膜和线粒体嵴等细胞器，或者与溶酶体结合形成自噬溶酶体。

4 讨论

自噬是真核细胞内特有的一种高度保守的代谢过程，通过清除胞质内受损或老化的细胞器及其代谢产物，从而维持内环境稳定。线粒体自噬是调控线粒体质量平衡和维持细胞稳态的重要机制，其发生的大致过程包括：细胞内的线粒体先发生去极化损伤，受损线粒体首先被双层膜结构所包裹，形成自噬体，然后被运输至溶酶体，并和溶酶体融合而形成自噬溶酶体，之后在溶酶体酶的作用下降解被包裹的线粒体，完成整个自噬过程[5]。在细胞自噬的研究中，用电子显微镜观察细胞质中双层膜包裹所形成的自噬体是评估自噬的形态学的金标准。

糖尿病心肌病(DCM)是一种常见的糖尿病并发症，心肌细胞的糖、脂代谢与能量代谢异常导致心肌细胞的凋亡、坏死和心肌纤维化引起的心肌结构改变。线粒体是心肌细胞能量代谢重要场所，在DCM的发病机理中具有重要作用。研究表明，细胞自噬在心脏重构中起着至关重要的保护作用，能够维持心脏功能以及心肌细胞内环境稳定[6]。心肌细胞通过线粒体自噬(mitophagy)作用不断清除受损或老化的线粒体，从而维持细胞稳态[7]。本实验中糖尿病模型大鼠出现心肌细胞肥大，肌丝扭曲，肌原纤维收缩蛋白明显减少，线粒体嵴碎裂、消失，线粒体空泡化，内质网扩张，心肌细胞呈凋亡状态改变，甜茶提取物组能显著恢复心肌细胞线粒体的超微结构，且出现了线粒体自噬现象，观察到线粒体形态较完整，内质网扩张减轻，心肌细胞凋亡减少，提示瑶山甜茶提取物能增强心肌细胞线粒体自噬，抑制心肌细胞凋亡，减轻心肌细胞损伤，从而改善糖尿病心肌病。

糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见的并发症，亦是引起终末期肾功能衰竭的主要原因，是糖尿病病人主要死因。足细胞被称为肾小球脏层上皮细胞，是一种高度特异性终末期分化的细胞，高血糖高血脂产生的活性氧自由基(ROS)对足细胞有直接损伤的作用，ROS能引起线粒体蛋白、脂质及线粒体DNA的损伤，导致线粒体功能障碍，细胞凋亡增加，机体通过线粒体自噬清除过多的ROS损伤的线粒体，从而延长细胞寿命[8]。足细胞损伤是慢性肾病病程进展的主要因素，也是临床治疗的重要靶点[9]。本实验中糖尿病模型大鼠出现足细胞超微形态学改变，线粒体空泡化，足细胞足突融合，内质网、高尔基体扩张，核形态不规则，核染色质边集，细胞核出现凋亡的早期形态改变。甜茶提取物可降低糖尿病大鼠的肾脏指数，改善肾小球足细胞的超微结构，减轻足突融合，清除受损的线粒体，抑制细胞凋亡，表现为空泡化的线粒体减少，足细胞凋亡减轻，出现包裹着残缺线粒体的自噬小体，提示瑶山甜茶提取物可调节线粒体自噬抑制足细胞凋亡。

肝脏是机体内物质代谢的主要场所，在血糖调节中起着重要作用。肝脏脂肪蓄积和线粒体功能障碍是糖尿病肝脏疾病发生发展的重要环节。研究表明，选择性线粒体自噬调控线粒体质量，减少受损线粒体蓄积，调节线粒体质量平衡[10-11]，在疾病早期适度激活细胞自噬，可能成为治疗糖尿病肝损伤的有效途径[12]。糖尿病大鼠肝细胞超微结构损伤，表现在细胞内脂滴增多，线粒体空泡，粗面内质网囊状扩张并脱颗粒，溶酶体增多，糖原颗粒减少，细胞核固缩、碎裂，核溶解，凋亡状态改变。本研究中，经甜茶提取物作用后，细胞内脂滴减少，并出现包含脂滴和线粒体的自噬体，线粒体空泡化减轻，内质网扩张减轻，细胞凋亡减少。

综上所述，低剂量广西甜茶提取物(3 g/kg)和高剂量广西甜茶提取物(6 g/kg)灌胃糖尿病大鼠后，均可使其血糖明显下降，差异具有显著性，说明广西甜茶对糖尿病大鼠具有明显的降血糖作用，且低剂量甜茶提取物效果较高剂量效果好。甜茶提取物能减少糖尿病大鼠肝、心、双肾的脏器指数，改善糖尿病大鼠心肌、肾组织、肝组织的超微结构，表明甜茶提取物可能是通过诱导细胞产生线粒体自噬从而减少凋亡的发生，维持细胞的稳态，改善糖尿病并发症。但线粒体自噬在其中是如何作用的？其具体的分子机制以及与凋亡的线粒体途径的相互作用关系如何？将在线粒体自噬相关蛋白和基因的水平上阐明。本研究提示线粒体自噬有可能为瑶山甜茶有效活性成分降糖及改善糖尿病并发症的新靶点，为瑶山甜茶进一步开发利用提供实验依据。