骨桥蛋白与草酸钙结石形成的关系研究进展

周威 黄群 孟冬冬

【关键词】 OPN;草酸钙;结石;发病机制

中图分类号：R195 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.04.018

泌尿系结石发病率在人群中居高不下，欧美地区调查研究显示， 5%～10%的人一生中至少发生1次泌尿系结石[1]。我国泌尿系结石平均发病率达到6.5%，南方地区更高，达到11.6%[2]。近年来，国内泌尿系结石的发病率呈上升趋势，并且经治疗后5年内复发率在50.0%以上[3]。尿路结石以草酸钙结石及其混合成分为主要类型。骨桥蛋白（Osteopontin，OPN）在体外能抑制草酸钙晶体的成核、生长和聚集，但在体内能促进草酸钙结石形成。现从OPN的结构、功能、与草酸钙结石的关系等方面做一概述。

1 骨桥蛋白概述及其结构特性

骨桥蛋白又名分泌性磷蛋白-1（SSP1），是一种可溶性蛋白质，存在于大多数体液中[4]，是由314个氨基酸组成的带负电荷的磷酸化糖蛋白，分子量为35 kDa。SPP1基因编码了OPN的五个不同亚型，其中OPN-a、OPN-b和OPN-c均由几个高度保守的结构域组成，主要包括RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）、识别序列 （GRGDS）、SVVYGLR序列、凝血酶切割位点（RSK）、N-末端富含天冬氨酸序列、钙结合位点和C-末端结合肝素结构域，其不同之处在于每种亚型在信号肽和天冬氨酸结构域之间的连接长度均不同[5]。OPN首先在骨中被发现，随后在胎盘、泌尿生殖道等部位及血液、乳汁等体液中也发现有OPN存在。

骨桥蛋白能发挥其生物学活性，是由于其分子内部含有两个钙结合区域、一个RGD序列与一个凝血酶裂解位点。其中，钙结合区域在钙离子介导或参与的反应过程中起重要作用，而后两者可以促进细胞黏附。RGD序列通过整合素介导参与晶体黏附于上皮细胞、细胞内信号转导等过程[6]。而OPN被凝血酶片段裂解后，隐藏的整合素连接位点162SLAYGLR168暴露，继而结合整合蛋白α4β1和α9β1[7]。作为细胞黏附蛋白和细胞因子，OPN通过与αvβ3-整合素和CD44的相互作用进一步介导细胞信号转导[8]。

2 骨桥蛋白的调节及其功能

骨桥蛋白在体内的表达受多种物质调节。一水草酸钙（COM）在尿路结石中占比最高，也是重要的OPN 调节因素。研究表明，OPN可促进体外培养的BSC-1 细胞表达OPN[9]。Yan等[10]发现大鼠经手术切除甲状腺后，不同浓度和时间梯度的促甲状腺素刺激会增加OPN的表达。Bouleftour等[11]研究发现甲状旁腺激素可促进小鼠OPN的表达。彭秀梅[12]在研究激素对牦牛OPN表达的影响时发现，黄体酮可明显促进牦牛输卵管上皮细胞骨桥蛋白表达，并且呈计量依赖性，而雌二醇则明显抑制OPN的表达。鞠华龙等[13]在研究生长激素对大鼠OPN表达的影响时发现，应用生长激素后，大鼠正畸牙齿移动时牙周组织中OPN的表达也受影响。结扎大鼠单侧输尿管24 h后，OPN和OPN mRNA 的表达量升高4倍，说明物理刺激可以影响OPN mRNA的表达。此外，维素生K3、维生素D3、骨化三醇也能促进OPN的合成与分泌。OPN是一种存在于大多数体液中具有多种功能的蛋白质，它主要的功能有：①细胞黏附，OPN能通过特定的依赖性RGD序列和非依赖性RGD序列结合细胞表面的整合蛋白受体，继而发挥细胞黏附作用;②细胞募集，OPN能指导成纤维细胞的迁移;③细胞因子表达，OPN-CD44的相互作用刺激IL-12产生免疫球蛋白，也能抑制IL-10和IL-4的表达[14];④与肿瘤发展相关，在实体器官肿瘤，如乳腺癌、前列腺癌等，OPN可以促进肿瘤细胞增殖、转移，通过自体吞噬的上调来增强化学抗性从而介导肿瘤化疗耐药性[15];⑤矿化作用，Foster等[16]研究发现OPN具有调节牙本质和骨的形成和矿化的非冗余作用;⑥细胞免疫，OPN调节先天免疫系统和适应性免疫系统，以与TH-1类似的方式起作用，促进细胞介导的免疫应答[17]。此外，OPN还可以抑制脂肪细胞分化，也能通过与整合αvβ1相互作用促进间充质干细胞的成骨分化，参与骨吸收，加速血管生成。

3 骨桥蛋白与草酸

体外实验证明，高浓度草酸能通过增加细胞膜的通透性、促进细胞DNA断裂等方式使细胞数量减少，它能对肾小管上皮细胞产生毒性作用，主要表现在以下2个方面：①促进UPTF1（凝血酶原片段1）的mRNA翻译成UPTF1蛋白，从而介导急性炎症反应，损伤肾上皮细胞，使肾小管上皮细胞凋亡和坏死;②对肾上皮细胞的毒性反应，包括改变细胞膜表面特性和细胞脂质、破坏线粒体功能、改变细胞基因表达、产生大量的活性氧簇，进一步激活各种信号分子和转录因子，最终导致尿液中某些大分子物质在肾小管上皮细胞中的表达上调[18]。目前认为肾上皮细胞损伤是结石形成的始动因素，随着尿液草酸浓度的增加，草酸钙结晶增加，草酸钙晶体沉积能直接增加OPN的表达。正常情况下，OPN的表达局限在Henle环和肾乳头表面上皮细胞，而在高草酸尿环境中，OPN表达增加，但仍主要局限于髓袢细段的基底膜间质中。然而，在草酸钙结晶聚集、沉积后，OPN在近端小管甚至整个肾脏中均有表达[19]。关晓峰等[20]通过乙二醇和氯化铵诱导建立高草酸尿症大鼠模型，随后测定尿液草酸浓度后发现OPN表达量随着尿液草酸浓度增加而增加，实验后期随着草酸浓度的降低而减弱。并且OPN表达起始于集合管，逐渐向髓袢蔓延，重吸收作用后尿液草酸浓度在集合管达到峰值，表明尿液草酸浓度可影响肾单位中OPN的表达，而且高表达于集合管与髓袢，提示肾集合管与髓袢可能是草酸钙结石形成的起始部位。综上所述，可以认为高浓度草酸能损伤肾小管上皮細胞，使草酸钙表达增加，随后加速草酸钙晶体聚集、成核、增加晶体滞留，从而促进结石的形成。

4 骨桥蛋白与草酸钙结石

4.1 肾组织中的骨桥蛋白与草酸钙结石

一般认为，骨桥蛋白能抑制草酸钙晶体的形成。Lieske等[21]研究发现，COM晶体能迅速结合肾上皮细胞，而且浓度越高，结合速度越快，推测其机制为OPN与草酸钙晶体表面黏附相关位点结合，从而阻止晶体与肾小管上皮细胞结合。Wesson等[22]用乙二醇分别诱导OPN基因敲除的成年小鼠和正常小鼠，形成高草酸尿模型，到第4周后，OPN基因敲除小鼠的肾小管内形成大量草酸钙晶体，而正常小鼠则无晶体形成，提示OPN能抑制草酸钙结晶形成。体外实验表明[23]，OPNAs3（3-磷酸丝氨酸肽）和OPNAs5（5-磷酸丝氨酸肽）浓度越高，二水草酸钙（COD）在溶液中的成核和生长越慢，并且增加OPN的磷酸化水平，对COD的抑制作用更强更稳定。為了研究OPN在COM结石形成过程中的作用，Langdon等[24]通过向人造尿液中添加OPN诱导草酸钙结晶形成，然后用扫描电子（SEM）和共聚焦显微镜研究OPN-COM相互作用，结果发现在低浓度的OPN中形成的COM晶体呈拉长的六边形，随着OPN浓度的增加，COM晶体形态逐渐变化，最终变成哑铃形晶体。进一步测量单个晶体的体积时发现，随着OPN浓度的增加，COM晶体体积不断减小，从而可以推断OPN通过抑制草酸钙结晶而抑制草酸钙结石的形成。关于OPN在草酸钙结石形成过程中的作用，部分学者却有不同的见解。Mo等[25]发现约10%的OPN基因敲除小鼠和14.3%THP（Tamm-Horsfall蛋白）基因敲除小鼠在肾乳头处自发形成磷酸钙沉淀，而正常小鼠则未出现任何沉淀，并且这2类小鼠的尿液均具有促进一水草酸钙晶体与肾上皮细胞黏附的能力。欧善际[26]用原位反转录-聚合酶链反应技术测定大鼠体外培养肾小管上皮细胞OPN mRNA 的表达发现，在受COM刺激后，大鼠肾小管上皮细胞OPN表达增强，但高浓度的COM 却降低OPN表达。Hirose等[27]进一步研究发现，小鼠经乙醛酸盐给药后，肾皮质-髓质连接处OPN蛋白表达逐渐增加，OPN mRNA表达从12小时开始增加，在24小时逐渐下降。在超显微结构观察中，6小时后OPN开始出现在肾远端小管的细胞晶核和塌陷的线粒体中，并在12小时后在肾小管管腔中逐渐检测到。在OPN基因敲除小鼠肾细胞中，24小时可见到塌陷的线粒体，但未见有晶核形成。表明肾小管细胞损伤后，OPN在损伤的细胞器中聚集，从而成为晶核形成的开始。同样的，吴敬彰等[28]研究OPN在结石患者肾组织中的表达时发现，结石组患者肾组织中的OPN表达量显著高于对照组。赵明等人[29]在研究骨桥蛋白对大鼠发生草酸钙肾脏结石的影响时发现，OPN siRNA组OPN蛋白表达水平显著低于空载组，显著高于对照组，而OPN siRNA组大鼠肾皮质和肾髓质草酸钙结石均显著低于空载组，显著高于对照组，从而可以认为OPN具有促进草酸钙肾结石形成的作用。邓茂放等[30]在研究乌梅提取物对肾结石模型大鼠肾功能的保护作用及机制时发现，模型组和实验组肾组织中OPN蛋白免疫组化评分明显高于正常组，模型组大鼠较正常组大鼠肾小管上皮细胞中OPN蛋白表达量增多，由此可以推断OPN促进结石形成。以上研究都表明OPN在促进肾小管中滞留的晶体转化为肾结石过程中起关键作用，甚至导致临床尿石症。

4.2 尿液中的骨桥蛋白与肾结石

一般情况下，尿液中钙离子、草酸根离子处于过饱和状态，但大多数人不形成结石，表明尿液中存在某些抑制结石形成的物质，可通过影响晶体结晶而抑制草酸钙结石形成。目前发现，存在尿液中的大分子结石抑制物包括：THP、OPN、枸橼酸盐、间α胰蛋白酶抑制物、S100A8蛋白、乙二胺四乙酸等[31]。其中，尿液中的OPN在抑制结石晶体形成过程起到关键作用。肾集合管及髓袢等部位合成并分泌OPN到尿液中，起到抑制结石形成的作用。OPN 的分泌无性别差异，与钙、肌酐排泄无直接关系，而与尿量的变化呈负相关[32]。Asplin 等[33]研究OPN对草酸钙晶体形成的作用时发现，抑制半数COM晶体生长、聚集的OPN浓度分别为（16±2）nmol/L、（28±4）nmol/L，而正常人尿液OPN 的浓度却高达（131±13）nmol/L，完全能够抑制尿草酸钙晶体的生长、聚集。Yasui等[34]测定结石患者尿液OPN浓度后发现，其浓度和排泄率均降低，并推测结石患者尿液中OPN含量降低可能有2种原因：①OPN合成量不足，使尿液中OPN浓度不足以抑制草酸钙结石的形成;②OPN的合成量正常，由于OPN掺入生长的结石中，经尿液排出的OPN减少，也不足以抑制结石的形成。Thurgood等[35]在研究晶体内和表面结合的OPN对COD晶体的影响时发现，在浓度分别为0 mg/L、1 mg/L和5 mg/L的OPN中，尿液中形成COD晶体的大小分别为21.9 μm、19.3 μm和16.5 μm，表明OPN抑制COD晶体生长，并且抑制作用呈剂量依赖性。王炎等人[36]在研究加味健脾益肾方对肾结石术后尿骨桥蛋白的影响时发现，治疗组治疗2周、4周时，尿OPN含量比治疗前明显升高，说明加味健脾益肾方可以通过提高尿中OPN水平进而抑制草酸钙结石形成。也有学者持相反的观点，Konya等[37]研究草酸钙晶体聚集和生长的抑制活性过程中发现，固定在胶原颗粒表面的OPN能增加草酸钙晶体的黏附和聚集，并且可以增加新形成的晶体的黏附力，高浓度的草酸钙也能将OPN包裹，成为结晶形成的始发部位，从而促进草酸钙结石的形成。

5 小结和展望

泌尿系结石是一种由多因素参与、形成过程非常复杂的疾病，发病机制目前还有待研究。OPN作为多功能的磷酸化糖蛋白，在结石晶体聚集、成核、生长环节中扮演着重要的角色。尽管已经对OPN与泌尿系结石的形成关系做了大量研究，但目前仍不能明确其在草酸钙结石形成中的具体作用。对OPN的结构、功能、调节、与草酸的关系等方面的研究，有助于为草酸钙形成机制的研究提供理论指导与依据，对于泌尿系结石的预防、降低结石病在人群中的发病率有一定的指导意义。

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（收稿日期：2019-01-06 修回日期：2019-01-21）

（编辑：梁明佩）