长链非编码RNA AFAP1—AS1的过表达对胃癌细胞增殖和迁移的影响

李周骁 唐薇薇 丁志丽

[摘要]目的 探討长链非编码RNA AFAP1-AS1的过表达对胃癌细胞增殖和迁移的影响。方法 采用定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测52例胃癌及癌旁标本（2015年5月～2017年1月在南京医科大学附属南京第一医院收集）和6例胃癌细胞株中lncRNA AFAP1-AS1的表达水平。小干扰RNA（siRNA）用于抑制胃癌细胞系中的AFAP1-AS1表达。结果 胃癌组织中的AFAP1-AS1水平显著高于相应的癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.01）。胃癌细胞系AGS、SGC7901、MGC803和BGC8231的表达量显著高于正常胃黏膜细胞系GES-1，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。AFAP1-AS1的表达水平与胃癌患者临床分期（χ2=7.137，P=0.008）和淋巴结转移（χ2=6.656，P=0.010）有关。CCK8和克隆集落形成实验显示，用siRNA敲降AFAP1-AS1的表达后，胃癌细胞系BGC823和MGC803的增殖速率显著降低，差异有统计学意义（P<0.01或P<0.001）。细胞划痕实验显示，用siRNA敲降AFAP1-AS1的表达后，胃癌细胞系BGC823和MGC803的增殖速率显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 AFAP1-AS1是一种参与胃癌进展的新型生物标志物，可能为治疗性干预提供潜在的预后生物标志物和潜在靶点。

[关键词]长链非编码RNA AFAP1-AS1；胃癌；肿瘤发生；增殖；迁移

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2019）5（a）-0004-05

Influence of overexpression of LncRNA AFAP1-AS1 on proliferation and migration of gastric cancer cells

LI Zhou-xiao1 TANG Wei-wei1 DING Zhi-li2 DONG Chao-xi1 RONG Da-wei1 CAO Hong-yong1▲

1. Department of General Surgery， Nanjing Hospital Affiliated to Nanjing Medical University （Nanjing First Hospital）， Jiangsu Province， Nanjing 210001， China； 2. Department of Pediatric ICU， Children′s Hospital of Changzhou City in Jiangsu Province， Changzhou 213003， China

[Abstract] Objective To explore the influence of overexpression of LncRNA AFAP1-AS1 on proliferation and migration of gastric cancer cells. Methods The expression levels of lncRNA AFAP1-AS1 in 52 cases of gastric cancer and paracancerous tissues which were collected from May 2015 to January 2017 and 6 gastric cancer cell lines were evaluated by quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction （qRT-PCR）. Small interfering RNA （siRNA） was used to suppress AFAP1-AS1 expression in gastric cancer cell lines. Results The level of AFAP1-AS1 in gastric cancer tissues was significantly higher than that in adjacent adjacent tissues， with significant difference （P<0.01）. The expression levels of AGS， SGC7901， MGC803 and BGC8231 in gastric cancer cell lines were significantly higher than those of normal gastric mucosal cell line GES-1， the difference was statistically significant （P<0.05 or P<0.01）. The expression level of AFAP1-AS1 was related to clinical stage （χ2=7.137， P=0.008） and lymph node metastasis （χ2=6.656 P=0.010）. CCK8 and colony colony formation experiments confirmed that the proliferation rate of gastric cancer cell lines BGC823 and MGC803 significantly decreased after knockdown of AFAP1-AS1 expression which induced by siRNA， the differences were statistically significant （P<0.01 or P<0.001）. Cell scratch assay confirmed that the proliferation rate of gastric cancer cell lines BGC823 and MGC803 significantly decreased after siRNA knockdown of AFAP1-AS1 expression， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion AFAP1-AS1 is a novel biomarker involved in gastric cancer progression， which may provide a potential prognostic biomarker and a prospective target for therapeutic intervention.

[Key words] lncRNA AFAP1-AS1； Gastric cancer； Tumorigenesis； Proliferation； Migration

胃癌是一種涉及多基因组改变的遗传性疾病，在发展中国家一直是严重影响人们身心健康乃至危及生命的主要疾病之一，并且近年来其发病率不断增加[1-2]。尽管目前胃癌的诊断和治疗技术不断发展，然而大多数患者仍然在晚期才得到确诊，因此预后较差[3-5]。目前，改进胃癌的早期诊断和靶向治疗是降低其死亡率的主要策略。

在过去的几十年中，大量研究聚焦于蛋白质编码RNA在癌症中的异常表达，这为癌症诊断和治疗提供了一种有前景的手段。然而，随着近年来高分辨率微阵列和全基因组测序技术的进步，越来越多从基因组学和转录组学研究中得到的证据显示，长链非编码RNA（lncRNA）可以作为癌症检测的新型生物标志物和癌症治疗的分子靶标[6-9]。其中，lncRNA肌动蛋白丝相关蛋白1反义RNA 1（AFAP1-AS1）被发现在卵巢癌、胆囊癌、食管鳞状细胞癌、胰腺导管腺癌、结直肠癌等肿瘤中异常高表达[10-14]，然而AFAP1-AS1是否参与了胃癌的发生和发展，目前仍不明了。本研究旨在探讨AFAP1-AS1在胃癌中的临床意义和生物学功能。

1资料与方法

1.1临床资料与手术标本

选取2015年5月～2017年1月于南京医科大学附属南京第一医院接受手术的52例胃癌患者的胃癌组织及相应癌旁组织标本。所有患者手术前均未接受放疗或化疗，标本离体后立即储存在-80℃冰箱中。本研究经南京医科大学附属南京医院医学伦理委员会批准，所有患者在参与研究前均签署书面知情同意书。

1.2 RNA提取和逆转录以及qRT-PCR

用Trizol试剂（Invitrogen）从癌组织及对应癌旁组织中提取总RNA，操作按照说明书进行；测量总RNA浓度，用Prime-ScriptTM qRT-PCR试剂盒（Takara，中国）逆转录cDNA。然后以该cDNA为模板，PCR仪中扩增提取的RNA进行反转录，采用SYBR Green染料法行实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）。使用三步法进行qRT-PCR，反应条件为：使用95℃反应10 min预变性，继续10 s变性，57℃ 20 s退火，72℃ 15 s延伸。每个待测样本设置3个平行样。通过以下引物序列的qRT-PCR检测AFAP1-AS1表达量：5′-TCGCTCAATGGAGTGACGGCA-3′（正向）；5′-CGGCTGAGACCGCTGAGAACTT-3′（反向）。结果用GAPDH作为内参物，正向5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′和反向5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。用ABI7500系统和SYBR Green PCR Master Mix进行qRT-PCR反应。采用2-△△CT法分析AFAP1-AS1在胃癌组织及相应的癌旁组织，分析靶基因的倍数变化。

1.3细胞培养

人胃癌细胞系MKN-28、MKN-45、BGC-823、SGC-7901、MGC-803和AGS购自上海细胞生物学研究所（上海）。使用RPMI-1640培养基加10%胎牛血清和青霉素（100 U/ml）、链霉素（100 U/ml）混合培养基培养细胞。培养条件：37℃恒温培养箱，5% CO2。

1.4 SiRNA的制备和转染

将细胞接种过夜，并使用Li-pofectamine Reagent（Invitrogen）在Opti-MEM培养基（Invitrogen）中用10 nM siRNA和无siRNA的空白对照（Invitrogen）转染。AFAP1-AS1靶向siRNA的序列如下（表1）。细胞生长后10～12 h进行转染实验。初始检测可以设置为多个浓度梯度来检测不同浓度的干扰效率。以10 nmol（1.2 μl）干扰浓度为例，每管加入100 μl Opti-MEM，加入1.2 μl阴性对照/干扰试剂，最后加入12 μl Hiperfect，其中本实验干扰效率终浓度为10 nmol。48 h后，收集细胞并使用qRT-PCR检测干扰效率。

1.5细胞增殖实验

根据说明，使用细胞计数试剂盒-8（CCK8，Promega）测定法测定细胞增殖。将转染的细胞接种在96孔板（3000个细胞/孔），每24小时监测1次。每孔中加入10 μl CCK8，在37℃细胞培养箱中孵育2 h，然后通过分光光度法在490 nm光度测量溶液，计算细胞活力。

1.6克隆集落形成实验

用si-AFAP1-AS1抑制剂转染细胞，在每个6孔板上用含有10%胎牛血清的培养基接种1×103个细胞，并于37℃、5% CO2条件下在细胞孵箱保存。转染的细胞置于6孔板中并保存14 d，每3天更换1次培养基。然后用1 ml PBS洗涤细胞，用4%多聚甲醛固定15 min，用0.1%结晶紫染色20 min，最后用1 ml水洗涤3次。手动计数菌落数，并通过双尾t检验评估差异，每个细胞系重复3次。

1.7划痕实验

在用si-AFAP1-AS1或si-NC转染48 h后，使用200 μl无菌移液器尖端在贴壁细胞中划痕。然后用PBS洗涤细胞3次以除去任何游离的细胞和碎片。加入不含血清的培养基，并在37℃、5%CO2条件下培养细胞。分别于转染后0、12 h后观察划痕愈合情况并用数字显微镜拍照。实验重复3次。

1.8统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 LncRNA AFAP1-AS1在胃癌组织中的表达

在AFAP1-AS1逆轉录为cDNA完成后，使用qRT-PCR检测52例胃癌组织中AFAP1-AS1的表达水平。结果显示，胃癌组织中lncRNA AFAP1-AS1的表达水平明显高于相应的癌旁组织，其在胃癌组织中的表达量约为癌旁组织中的2.8倍，差异有统计学意义（n=52，P<0.01）（图1）。

2.2 LncRNA AFAP1-AS1的表达与患者临床病理特征的关系

在两组患者中，以LncRNA AFAP1-AS1在胃癌细胞中的表达水平与正常胃黏膜细胞的对比将其分为高表达组及低表达组。单因素分析LncRNA AFAP1-AS1的表达与患者临床病理特征的关系，结果显示，肿瘤组中LncRNA AFAP1-AS1的表达与患者的TNM分期（χ2=7.137，P=0.008）和淋巴结转移（χ2=6.656，P=0.010）有关，与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位和胃癌患者的肿瘤分化程度无关（P>0.05）（表2）。

2.3 LncRNA AFAP1-AS1在胃癌细胞系中的表达

胃癌细胞系AGS、SGC7901、MGC803和BGC823中AFAP1-AS1的表达显著高于正常细胞系GES-1（P<0.05），其中MGC803和BGC823的表达量最高，其相对表达量分别约为正常胃黏膜细胞GES-1的5.3倍与3.4倍。然而，在胃癌细胞系MKN28和MKN45中，AFAP1-AS1的表达与正常胃癌细胞比较，差异无统计学意义（P>0.05）（图2）。

2.4 AFAP1-AS1促进胃癌细胞系MGC-803和BGC823的增殖

笔者设计了两条干扰序列si-AFAP1-AS1-1和si-AFAP1-AS1-2抑制AFAP1-AS1的表达并在体外实验中测试其生物学功能。选择AFAP1-AS1表达最高的胃癌细胞系MGC803和BGC823以确定转染效率，分别用阴性对照（NC）、si-1和si-2转染MGC803和BGC823，36 h后，MGC803和BGC823中AFAP1-AS1的表达量显著下降，qRT-PCR显示si-1和si-2在胃癌细胞系MGC803和BGC823中对AFAP1-AS1的抑制效率良好（P<0.01）（图3A）。CCK8实验结果显示敲降AFAP1-AS1显著抑制了胃癌细胞MGC803和BGC823的增殖（P<0.001）（图3B、图3C）。此外，克隆集落实验的结果也显示敲降AFAP1-AS1抑制了胃癌细胞的增殖（P<0.01）（图3D、图3E）。

2.5 AFAP1-AS1对胃癌细胞株MGC-803和BGC823迁移能力的影响

在胃癌细胞系MGC-803和BGC823中，在细胞干扰后0、12 h通过细胞划痕拍摄细胞。如图4所示，与阴性对照组相比，敲降AFAP1-AS1表达后，胃癌细胞系MGC-803和BGC823的迁移能力受到显著抑制（P<0.05）。

3讨论

胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，对人体健康构成严重威胁。lncRNA是一类长度超过200个碱基对的核苷酸序列[15]。越来越多的证据显示，lncRNA广泛参与生物体各类重要生理过程，在转录、转录后表观遗传水平上对靶基因的表达进行调控，也参与调控细胞周期及肿瘤转移发生[16]。研究显示lncRNAs与肿瘤的发生、发展密切相关，近年来已成为临床医学研究的热点之一。

以往研究发现，lncRNA AFAP1-AS1的上调与非小细胞肺癌患者的不良预后相关[17]。另有文献报道，其表达上调与鼻咽癌的进展和预后不良有关[18]。然而，目前其在胃癌发生、发展中的生物学作用仍不清楚。本研究证实了AFAP1-AS1在胃癌中的表达，并评估了其与临床因素的相关性，通过siRNA介导的敲降探索了AFAP1-AS1的潜在功能。

本研究结果显示，AFAP1-AS1在患者胃癌组织中的表达量显著增高（P<0.05），这与其他报道一致[19]。此外，AFAP1-AS1与临床病理特征的关联性揭示了AFAP1-AS1的过表达与胃癌患者的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位或分化程度无关（P>0.05），与临床分期和淋巴结转移有关（P<0.05），AFAP1-AS1表达量较高的胃癌患者更易发生淋巴结转移。众所周知，具有淋巴结转移的胃癌比无淋巴结转移的胃癌预后更差[20]，TNM分期也是预后经典评估标准，Ⅲ期和Ⅳ期患者的预后较TNM Ⅰ期和Ⅱ期更差[21]。总之，AFAP1-AS1可作为评估胃癌风险的潜在生物标志物，并且可以作为胃癌预后的生物标志物。

为了进一步了解AFAP1-AS1在胃癌细胞中的生物学功能，本研究进行了体外实验。在细胞实验中，与胃正常细胞系GES-1相比，胃癌细胞系MGC-803和BGC823的AFAP1-AS1表达量最高，因此选择BGC823和MGC-803进行进一步研究，结果显示，敲降AFAP1-AS1的表达后，MGC-803和BGC823细胞系的增殖速率受到显著抑制。此外，本研究进行了划痕实验来证实AFAP1-AS1对胃癌细胞迁移能力的影响。实验结果显示，敲降AFAP1-AS1的表达后，胃癌细胞系MGC-803和BGC823的迁移能力受到显著抑制（P<0.05）。

需要重视的是，这项研究仍存在一些不足之处。AFAP1-AS1可能促进胃癌的增殖和迁移的结论是基于人胃癌组织和胃癌细胞系的体外实验和临床样本数据分析得出，还需要进行动物实验深入验证实验结果，进一步进行基于基因敲除小鼠的实验也可以提升实验的可信度。此外，本研究尚未涉及特定的分子机制，在未来的研究中需要阐明AFAP1-AS1促进胃癌增殖的具体机制。

综上所述，AFAP1-AS1在胃癌中高表达，提示AFAP1-AS1是一种胃癌特异性lncRNA。其可能在胃癌的发生、发展中起重要作用，敲降lncRNA AFAP1-AS1抑制MGC细胞中的细胞增殖和迁移。研究结果显示，lncRNA可能在胃癌中发挥作用，有望成为胃癌诊断和治疗靶点的新靶标。

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（收稿日期：2018-08-21 本文编辑：祁海文）