TGF-β1诱导体外培养人肾小管上皮细胞的表型转化

王雪瑶，陈 爽，王小丛*

(吉林大学第一医院 1.心脏超声科；2.生殖中心产前诊断中心，吉林 长春130021)

肾慢性纤维化是多种肾脏疾病发展到终末期的共同表现，是以肾小管萎缩消失、间质肌成纤维细胞增生并产生细胞外基质为特征的病理过程[1]。肾纤维化时肌成纤维细胞的来源除肾间质内固有肌成纤维细胞活化增生外，近年来研究发现肾小管上皮细胞经上皮-间充质细胞转分化，或称上皮向间充质细胞的表型转化也是肾纤维化肌成纤维细胞的重要来源之一[2]。所谓上皮-间充质细胞转分化是指肾小管上皮细胞出现了间充质细胞标记物，包括α-平滑肌动蛋白(α-SMA)和波形蛋白(vimentin)等，同时其上皮细胞标记物表达的降低或消失，如E-钙粘附蛋白和细胞角蛋白(CK)等。关于慢性肾纤维化，据报道有促肾纤维化作用的细胞因子很多，目前较公认的促纤维化因子要属转化生长因子-β1(TGF-β1)[1]，TGF-β1促肾纤维化形成的机制尚未完全阐明。本研究以人肾小管上皮细胞体外培养细胞系、HK-2 细胞为观察对象，观察TGF-β1是否具有诱导体外培养HK-2细胞出现上皮向间充质细胞表型转化能力，期望能为慢性肾纤维化研究提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

1.1.1细胞系：HK-2 细胞系(人肾小管上皮细胞体外培养细胞系)购于中国医学科学院基础医学研究所，培养于含10%胎牛血清(FBS)DMEM/F12培养液。

1.1.2主要试剂：广谱细胞角蛋白(CK)、E-钙粘附蛋白和α-SMA的单克隆抗体，及免疫组织化学UltraSensitiveTM S-P超敏试剂盒购自福州迈新公司。TGF-β1购自Peprotech 公司。RNA抽提试剂、逆转录试剂，PCR试剂盒TAKARA公司产品。

1.1.3引物：根据GENBANK数据分别设计α-SMA、细胞角蛋白-19(CK-19)、波纹蛋白(vimentin)和β-actin的PCR引物，引物由上海生工生物工程技术公司合成，序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1HK-2培养细胞爬片：收集10% FBS DMEM/F12培养的HK-2细胞，以4×103个/孔接种于放有盖玻片24孔培养板， 在37℃、5%CO2条件10% FBS DMEM/F12培养24 h、无血清DMEM/F12继续培养24 h，各诱导各组0.5 ml的DMEM/F12培养体系中加TGF-β1，使TGF-β1终浓度分别为1 μg/L、5 μg/L和10 μg/L，对照组细胞加等体积0.1M PBS代替TGF-β1。每组设10个重复样；分别于诱导培养24 h，48 h，72 h取出盖玻片，4%多聚甲醛室温固定细胞30 min。

1.2.2免疫细胞化学染色：以CK和E-钙粘附蛋白为上皮细胞标记物；α- SMA为间充质细胞的标记物。上述固定的细胞经0.1%TritonX-100细胞打孔15 min，PBS洗5 min×3次；分别滴加一抗(抗CK抗体、E-钙粘附蛋白抗体和α-SMA抗体，1∶200稀释)4℃过夜，按UltraSensitiveTM S-P超敏试剂盒说明操作，DAB显色、苏木素复染细胞核。试剂盒提供的阳性片做阳性对照，0.01M PBS代替一抗为阴性对照。结果判定：根据DAB着色的有无，细胞明确棕黄色着色为阳性，无着色为阴性。

1.2.3RT-PCR检测：以CK-19为上皮细胞标记物；vimentin和α-SMA为间充质细胞标记物，β-actin为RT-PCR的内参。收集培养HK-2细胞，3×105接种于25 cm的培养瓶中，后续培养及TGF-β1诱导浓度分组同上，诱导培养48 h用Trlzol法提取细胞总RNA，按逆转录试剂说明书逆转录合成第一条cDNA链，以等量cDNA为模板进行PCR反应，分别检测CK-19、vimentin和α-SMA 的mRNA 表达。PCR反应条件：94℃变性1 min，进入循环，94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min；共 30个循环；最后72℃延伸5 min。2%琼脂糖凝胶电泳，阳性条带以电泳凝胶定量分析系统 (EDAS120,Kodak) 进行灰度扫描，计算各标记物mRNA相对表达量。计算公式为：mRNA相对表达=标记物 mRNA 平均密度值/内对照β-actin 平均密度值。

1.3 统计学分析简明统计软件10.32进行统计学分析，多组计量资料比较采用方差分析，相互比较，两组均数之间用q检验，P<0.05具有显著性差异。

2 结果

2.1 TGF-β1诱导HK-2细胞的免疫细胞化学染色

在TGF-β1浓度分别为1 μg/L、5 μg/L和10 μg/L条件下诱导培养HK-2细胞至24 h，其上皮细胞标记物E-钙粘附蛋白的阳性染色与对照组相比无明显差异；继续诱导48 h E-钙粘附蛋白染色强度有所减少；当诱导培养至72 h 各诱导组细胞E-钙粘附蛋白表达与对照组相比明显减少，10 μg/L TGF-β1诱导组E-钙粘附蛋白染色消失为阴性。但上皮细胞的另一个标记物CK的阳性表达，无论是在诱导培养的24 h、48 h、还是72 h与对照组相比均未见有明显差异。同时间充质细胞的标记物α-SMA免疫细胞化学染色表现为：诱导培养致48 h，各诱导组细胞均出现α-SMA染色的可疑阳性；继续诱导培养达72 h，各诱导组细胞的α-SMA阳性染色明确，即各诱导组HK-2细胞出现了明确的间充质细胞标记物的阳性表达。 以5 μg/L的TGF-β1诱导组，HK-2细胞的α-SMA阳性表达最强。即HK-2细胞经TGF-β1诱导培养后，其上皮细胞标记物E-钙粘附蛋白表达明显减少，同时出现有间质细胞标记物α-SMA的阳性，说明TGF-β1诱导使体外培养的HK-2细胞出现了上皮向间充质细胞的表型转化。

2.2 TGF-β1诱导RT-PCR检测

为验证免疫细胞化学染色结果，选择CK-19为上皮细胞标记物，α-SMA和vimentin为间充质细胞标记物，以同样的TGF-β1浓度和条件诱导培养HK-2细胞48 h，RT-PCR检测各标记物的mRNA表达，结果见表2。表2中可见在TGF-β1浓度分别为1 μg/L、5 μg/L和10 μg/L诱导培养后， HK-2细胞的上皮细胞标记物CK-19 mRNA的阳性表达对照组相比未见有明显改变，但其间充质细胞标记物α-SMA和vimentin的mRNA表达出现了明显的增高，间质细胞标记物mRNA的表达增高也是以5 μg/L TGF-β1诱导组为最明显，与免疫细胞化学染色结果相对应。进一步提示TGF-β1可诱导HK-2细胞出现上皮-向间充质细胞的表型转化，以TGF-β1浓度为5 μg/L诱导组细胞的表型转化最为明显。

表2 HK-2细胞各标记物mRNA相对表达量(mean±s，n=4)

*P<0.01 与对照组相比;ΔP<0.01与另两剂量组比较

3 讨论

肾间质内肌成纤维细胞形成及其产生的细胞外基质积聚被认为是慢性肾纤维化的关键因素[3]。1995年Strutz等观察到肾小管上皮细胞在接触肾毒素后可转化成具有纤维细胞特征的细胞并能表达波形蛋白，率先提出了肾小管上皮细胞的“上皮-间充质细胞转分化”概念，现亦可称为“上皮向间充质细胞的表型转化”，随后越来越多的实验提示肾小管上皮细胞出现的表型转化是肾纤维化肌成纤维细胞重要来源之一[4,5]。到目前为止，人们认为肾纤维化肌成纤维细胞的来源至少有如下几种可能：肾间质成纤维细胞，血管旁周细胞，骨髓来源的纤维细胞，肾小管上皮细胞，血管内皮细胞和巨噬细胞[6]。

无论肌成纤维细胞的来源如何，肾纤维化均是由肾脏损伤所释放的损伤因子引起，包括：TGF-β1、结缔组织生长因子、白细胞介素-1、血管紧张素II、蛋白酶、纤溶酶元激活物抑制剂-1和糖化终产物等[1.3,7]；损伤因子刺激或诱导肾内肌成纤维细胞形成并产生细胞外基质[7]。为进一步探讨肾纤维化的形成机制，本研究选择目前较公认的促纤维化因子TGF-β1，观察TGF-β1是否具有诱导体外培养人肾小管上皮细胞系HK-2出现上皮向间充质细胞的表型转化，结果显示在TGF-β1浓度分别为1 μg/L、5 μg/L和10 μg/L条件下，虽然HK-2细胞CK的免疫细胞化学阳性染色始终未见有明显改变；但上皮细胞另一个标记物E-钙粘附蛋白的阳性染色则有所降低，诱导至72 h E-钙粘附蛋白阳性染色与对照组相比明显减少，10 μg/L TGF-β1诱导组E-钙粘附蛋白表达甚至消失；同时间充质细胞标记物α-SMA在HK-2细胞诱导培养48 h出现了可疑阳性染色，继续诱导至72h α-SMA的阳性染色明确。 说明TGF-β1能够诱导体外培养的HK-2细胞出现上皮向间充质细胞的表型转化。为验证免疫细胞化学染色的结果，本研究用RT-PCR进一步检测各标记物的mRNA；结果显示HK-2细胞经TGF-β1诱导，其间充质细胞标记物α-SMA和vimentin的 mRNA表达明显增高，但上皮细胞标记物CK-19的mRNA表达未见有明显降低或消失，这与免疫细胞化学染色结果相对应。 本实验从mRNA 和蛋白水平上证实了TGF-β1可诱导HK-2细胞出现间充质细胞的标记物的阳性表达和表达增高,但其上皮细胞标记物仅表现为部分标记物表达的减少或消失，并非是所有的上皮细胞标记物表达的减少消失，该现象意义尚不清楚。实际一直以来体内的肾小管上皮细胞是否有完整“上皮-间质细胞转分化”始终存有争议，因为通过谱系追踪方法在体内无法证明肾小管上皮细胞能完全转变为肌成纤维细胞[8]，因此近期研究又提出了“部分上皮-间质细胞转分化”的概念，主要是指肾小管上皮细胞获得间质细胞的部分特征如表达α-SMA等，但并未完全转化为肌成纤维细胞，并且认为肾小管上皮细胞虽未能转变为肌成纤维细胞，但其出现的细胞表型改变或表型转化足够影响肾纤维化的进程[9,10]。

从TGF-β1诱导的剂量上看，本实验免疫细胞化学染色和RT-PCR检测结果均显示间充质细胞标记物α-SMA和vimentin阳性表达的最强出现在TGF-β1浓度为5 μg/L诱导组，并非是浓度最高的10 μg/L组，促纤维化因子TGF-β1在体内促肾小管上皮细胞发生表型转化等一系列过程是否也依赖于TGF-β1的计量等相关问题有待于进一步研究。

总之，本研究结果显示TGF-β1可诱导体外培养的HK-2细胞发生上皮向间充质细胞的表型转化，表型转化能力与TGF-β1剂量相关；进一步提示促纤维化因子TGF-β1可通过促肾小管上皮细胞的表型转化参与或促进慢性肾纤维化的形成。