血清长链非编码RNA H19、ATB和UCA1在宫颈癌的差异表达及相关性分析

宋小青，王革玲

(湖北江汉油田总医院妇产科，湖北潜江 433124)

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，多发于30～50岁女性，近年来有年轻化趋势[1]。早期宫颈癌患者常无明显症状和体征，宫颈可光滑或难与宫颈柱状上皮异位区别，此类患者多因宫颈外观正常易漏诊或误诊。随着病变发展，可出现阴道流血、阴道排液，甚至出现尿频、尿急、便秘、下肢肿痛等晚期临床症状，此时患者多已处于中晚期，预后往往较差。目前宫颈癌的诊断主要依赖宫颈刮片细胞学检查、宫颈和宫颈管活组织检查等病理学检查，但上述操作均为有创性检查，给患者造成了一定的痛苦，这也会导致人们不愿意定期进行筛查[2]。故而，寻找有效、稳定的生物学标志物无疑可为宫颈癌的治疗赢得时间，对提高患者生存率，改善其生存质量具有重要意义。

长链非编码RNA(LncRNA)与肿瘤的发生、发展及转移密切相关[3]。LncRNA是一类长约200 nt的非编码RNA，通过表观遗传调控参与各种生理病理过程，已被证实在前列腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌等泌尿生殖系统肿瘤中具有较大诊断价值[4-7]。本研究收集了130例经病理确诊的宫颈癌患者，同期收取130例宫颈炎患者和130例体检健康女性，检测并比较3组研究对象血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1水平，分析三者与宫颈癌临床病理特征之间的关系及对宫颈癌鉴别诊断的价值，旨在为宫颈癌的早期筛查提供新的思路。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年8月至2018年4月在本院经病理学/细胞学确诊的宫颈癌患者130例。年龄25～54岁，平均(38.0±4.6)岁。其中鳞癌89例，腺癌25例，腺鳞癌16例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期87例，Ⅲ～Ⅳ期43例；发生淋巴结转移40例，未发生淋巴结转移90例。宫颈癌的诊断、病理分型及分期依据美国国立综合癌症网络(NCCN)临床实践指南2015年第2版[8]。同期收取130例宫颈炎患者，年龄23～46岁，平均(35.9±4.1)岁。宫颈炎的诊断依据2015年美国疾病预防与控制中心(CDC)指南[9]。此外，收取130例本院体检健康女性，年龄24～48岁，平均(36.9±4.4)岁。纳入标准：(1)宫颈癌患者未接受放化疗治疗；(2)意识清楚，语言表达能力正常，能与调查人员进行正常的沟通；(3)与研究者进行研究目的沟通后，研究对象自愿参与本研究。排除标准：(1)既往有其他肿瘤疾病史者；(2)排除脑卒中、老年痴呆等神经系统疾病导致的无法采集相关信息和精神分裂症的患者；(3)患者或患者家属不愿意参与研究者。本研究的开展经医院伦理委员会批准，所有纳入对象均签署了项目知情同意书。

1.2临床资料与样本的采集 由研究人员记录患者的年龄、身体质量指数(BMI)、吸烟史、饮酒史等基本信息，BMI计算方法为体质量/身高2(kg/m2)。使用促凝采血管收集经禁食10 h以上宫颈癌及宫颈炎患者接受治疗前和健康对照者入院体检时的静脉血5 mL。收集的标本在1 h内于4 ℃离心机(中国湘仪集团H-1850R型)以3 500 r/min离心10 min，收集上层血清，并放入-80 ℃冰箱保存备检测。

1.3血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1相对表达量检测 血清总RNA的提取按照血液RNA提取试剂盒(中国Bioteke公司)说明书步骤进行。取上述提取的RNA，使用去除基因组逆转录试剂盒(中国Takara公司)逆转录为cDNA，进行实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)(美国Bio-Rad公司C1000型)。RT-PCR按照SYBR GREEN(中国康为世纪公司)说明书进行，反应体系为：Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，DEPC水6.4 μL。荧光定量PCR循环条件：95 ℃变性5 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45个循环，每组设置3个复孔。内参基因采用GAPDH。应用PrimerPremier5.0进行PCR引物设计，引物序列为：LncRNA-H19上游：5′-AAT CCT TTA TGT GAC CAG AA-3′，下游：5′-CTC CTT TGT TGA ATC CAT-3′；LncRNA-ATB上游引物：5′-AGT GTG TCC TGT TCT CCC AGT-3′下游引物：5′-TGG GGG AAT CTT TCG CAT T-3′； LncRNA-UCA1上游引物：5′-AGT GTG TCC TGT TCT CCC AGT-3′下游引物：5′-TGG GGG AAT CTT TCG CAT T-3′；GAPDH上游：5′-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3′， 下游：5′-GCA GGA GGC ATT GCT GAT GAT-3′。引物合成由北京赛百盛基因技术有限公司提供。采用2-ΔΔCt法计算LncRNA的相对表达量，△Ct值=样本Ct值-GAPDH Ct值。RT-PCR结果显示，血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1和GAPDH基因熔解曲线峰型单一，说明引物没有形成引物二聚体，也没有非特异性扩增，如图1。同时计算血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1检测的批内、批间变异系数，以评估实验的重复性和精确度。

注：图A示LncRNA-H19；图B示LncRNA-ATB；图C示LncRNA-UCA1；图D示GAPDH

图1LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1和GAPDH基因熔解曲线峰型

2 结 果

2.1基本资料及血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1水平比较 宫颈癌患者、宫颈炎患者和体检健康者之间在年龄、BMI、吸烟、饮酒差异无统计学意义(P>0.05)。与宫颈炎患者和体检健康者相比，宫颈癌患者血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1水平显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)，而宫颈炎患者和体检健康者间血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1水平差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1与宫颈癌临床特征的关系 如表2所示，血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1表达水平与宫颈癌患者的年龄、BMI、吸烟、饮酒和组织学类型等因素差异均无统计学意义(P>0.05)，而与宫颈癌患者发生淋巴结转移(LncRNA-H19：r=0.521，P=0.006；LncRNA-ATB：r=0.505，P=0.011；LncRNA-UCA1：r=0.486，P=0.023)及患者TNM分级(LncRNA-H19：r=0.513，P=0.016；LncRNA-ATB：r=0.591，P=0.003；LncRNA-UCA1：r=0.509，P=0.007)呈线性关联。

表1 基本资料及血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1水平比较

注：与宫颈癌患者比较，aP<0.05

表2 血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1与宫颈癌临床特征的关系

表3 血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1对宫颈癌的风险评估

注：a表示校正年龄、BMI、吸烟、饮酒等因素

2.3血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1对宫颈癌的鉴别价值 ROC曲线分析显示，血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1在区分宫颈癌与宫颈炎和健康对照者的AUC分别为0.815(95%CI：0.672～0.908，P<0.001)、0.841(95%CI：0.754～0.927，P<0.001)和0.612(95%CI：0.558～0.706，P=0.002)；在各指标约登指数为最大值时对应的灵敏度/特异度分别为：78.5%/86.9%、78.7%/90.7%和70.2%/59.3%；诊断界值分别为8.6(-log)、28.8(-log)和9.5(-log)，见图2A。联合血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1在区分宫颈癌与宫颈炎和健康对照者的AUC为0.923(95%CI：0.893～0.974，P<0.001)，灵敏度92.3%，特异度83.4%，见图2B。

2.4血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1对宫颈癌的风险评估 单因素分析显示，血清高LncRNA-H19、高LncRNA-ATB和高LncRNA-UCA1水平是宫颈癌发病的危险因素(P<0.05)；多因素分析显示，在校正年龄、BMI、吸烟、饮酒等因素后，血清高LncRNA-H19、高LncRNA-ATB和高LncRNA-UCA1水平仍是宫颈癌发病的独立危险因素(P<0.05)，见表3。

注：A图示血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1在区分宫颈癌与宫颈炎和健康对照；B图示联合血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1在区分宫颈癌与宫颈炎和健康对照

图2血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-

UCA1对宫颈癌鉴别价值

3 讨 论

宫颈癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，具有发病率高、侵袭性强以及预后差等特点，是威胁人群健康的主要疾病之一[10]。生物标志物是血液、尿液或者组织中能检测疾病状态的分子指标，可用于疾病的检测与评估[11-12]。它们在体液中的水平变化可以提供疾病进展情况的相关信息，理想情况下，生物标志物应具有检测早期小块肿瘤的高灵敏度、高特异度，并且在非肿瘤中不会增加。目前，对于宫颈癌的诊断仍然缺乏有效指标，导致这类患者预后较差，而生物标志物的早期检测可显著提高宫颈癌患者的生存率。

近年来，关于LncRNAs在宫颈癌领域的相关功能学研究逐渐成为新的热点。目前已经发现了近10种LncRNAs与宫颈癌细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭等过程有关。例如，PENG等[13]对419例宫颈癌患者的一项荟萃分析结果表明，LncRNA-H19表达水平与肿瘤直径、淋巴结转移状态、TNM分期等密切相关，且高水平的LncRNA-H19提示更差的临床预后。随后研究发现其可能的机制是LncRNA-H19可诱导肿瘤组织高表达癌基因HOXA11，从而促进肿瘤细胞的侵袭转移[14]。LncRNA-ATB也被证实参与宫颈癌的发病过程。CAO等[15]对50对宫颈癌及癌旁组织中LncRNA-ATB的表达进行比较分析发现，癌组织中LncRNA-ATB表达水平显著高于癌旁组织，提示LncRNA-ATB对鉴别诊断宫颈癌具有潜在价值，进一步利用永生化宫颈癌Hela细胞系进行体外实验的结果表明，LncRNA-ATB可通过TGF-β途径诱导上皮间质转化，进一步促进宫颈癌细胞的耐药，并增强其侵袭能力。除LncRNA-H19与LncRNA-ATB外，近年来关于LncRNA-UCA1与宫颈癌的研究也有一定进展。例如，FANG等[16]的体外实验证实，LncRNA-UCA1可作为内源竞争RNA取代miR-184并上调DUSP7表达，进而促进宫颈癌的发病。FAN等[17]发现，LncRNA-UCA1在宫颈癌等多种肿瘤组织中均呈高表达状态，而靶向抑制LncRNA-UCA1则可促进宫颈癌细胞凋亡，并降低其迁移能力。上述研究结果提示，LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1可通过多种途径参与宫颈癌的发病过程，而三者的异常表达可能为宫颈癌的早期诊断提供线索，但目前国内外鲜有关于联合上述3种LncRNA与宫颈癌诊断的相关报道。

在本次研究中，笔者探究了血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1对宫颈癌的诊断价值，并分析了三者与宫颈癌临床病理特征之间的关系。研究结果表明，宫颈癌患者血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1水平较宫颈炎及健康对照者显著增高，该研究结果与前期多个研究结果相符[13-17]。联合3项指标诊断宫颈癌的灵敏度高达92.3%，显著高于单项指标灵敏度，表明联合检测血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1诊断宫颈癌具有一定价值，可考虑在临床推广使用。此外，本研究再次证实，LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1表达水平与宫颈癌的淋巴结转移、TNM分期显著相关，Logistic回归多因素分析显示，在校正年龄、BMI、吸烟、饮酒等因素影响后，血清高LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1水平仍是宫颈癌发病的独立危险因素，上述这些结论与前期国外研究结果相一致[14-15,17]，表明LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1表达水平对宫颈癌患者肿瘤的转移及预后有一定预测作用。然而，本次研究仍有以下不足：(1)本次研究纳入的患者均来自于本院，这可能会对研究结果造成一定的偏倚影响，今后需要多中心的队列研究来进一步验证研究结果；(2)本研究纳入130例宫颈癌患者，患者的例数仍然有限，后期需要更大样本量的研究来证实血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1在我国宫颈癌患者中的临床价值。

4 结 论

本研究发现血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1对宫颈癌的诊断及发病风险评估中具有潜在价值，有望为宫颈癌的临床诊疗提供新思路。