化学发光法定量检测抗ENA抗体和抗dsDNA抗体临床性能评价

柳晓琴，崔亚利，沈 川，甘春玉，段义飞，彭磊文，李文胜△

(1.四川大学华西第二医院临床检验科,四川成都 610041；2.出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室,四川成都 610041)

自身抗体是机体B淋巴细胞成熟分化为浆细胞后产生的针对自身成分的抗体总称，高效价自身抗体的产生是绝大多数自身免疫性疾病(AID)的特征之一。自身抗体对于AID的诊断、病情判断、疗效观察具有重要作用，多种自身抗体已被纳入AID诊断指南中[1]，自身抗体的靶抗原众多，其中抗可提取物核抗原抗体(抗ENA抗体，包括抗Scl-70抗体、抗Sm抗体、抗Jo-1抗体、抗RNP/Sm抗体、抗SSB抗体、抗SSA抗体)是最常见的检测指标[2-5]。已有研究表明，抗双链DNA抗体(抗dsDNA抗体)对诊断系统性红斑狼疮(SLE)具有较高的特异度，特别是与狼疮性肾炎有关，且滴度与SLE病情的进展相关[6]。与定性检测相比，抗ENA抗体和抗dsDNA抗体定量检测不仅可以更好地辅助疾病诊断，而且可以有效地反映病情、判断预后和监测疗效。因此，已有的专家共识明确表示自身抗体的检测结果建议以定量或半定量方式表达[7]。

临床实验室在开展自身抗体定量检测方法选择前，应严格按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)EP系列文件的要求，对方法学开展临床性能评价。本研究利用临床样本对SMART-6500化学发光自身抗体定量检测平台(SMART-6500)开展抗ENA抗体和抗dsDNA抗体检测性能的评价，为临床实验室在抗ENA抗体和抗dsDNA抗体检测方法学的选择提供相应的依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2018年四川大学华西第二医院常规开展抗ENA抗体和抗dsDNA抗体项目检测的血清样本共329例。其中包含76例SLE样本和88例健康体检样本，其余165例为实验室常规检测样本。抗dsDNA抗体国际标准物质(NIBCS代码：15/174)从世界卫生组织(WHO)标准制定机构获得。

1.2仪器与试剂 化学发光(CLIA)自身抗体定量检测平台(SMART-6500)由重庆科斯迈生物科技有限公司生产并提供。CLIA检测试剂盒由江苏浩欧博生物医药股份有限公司生产并提供。抗ENA抗体检测项目包括：抗核糖核蛋白抗体(anti-RNP)、抗史密斯抗体(anti-Sm)、抗干燥综合征抗原A抗体(anti-SSA)、抗干燥综合征抗原B抗体(anti-SSB)、抗硬皮病70抗体(anti-Scl-70)、抗组胺酰tRNA合成酶抗原抗体(anti-Jo-1)等6个不同项目。以上试剂盒(含质控品和校准品)的批号分别为20180224、20180224、20180329、20180224、20180702和20180614；抗dsDNA抗体检测试剂盒的批号为20180801。每个试剂开展检测前首先使用校准品对检测主曲线进行两点校准，在开展样本检测前通过检测高值和低值质控品测值确认检测系统的稳定性，从而确保样本的检测结果。酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒由德国欧蒙医学诊断股份公司提供，抗ENA抗体检测项目包括：anti-RNP、anti-Sm、anti-SSA、anti-SSB、anti-Scl-70、anti-Jo-1等6个不同项目。以上试剂盒的批号分别为E181112CI、E180625DE、E180914AZ、E180601BQ、E180619IG和E181115BL，抗dsDNA抗体检测试剂盒的批号为E180905CG。ELISA测定仪器为瑞士TECAN 150/3全自动酶免仪。

1.3方法

1.3.1CLIA检测 试剂均严格按照说明书流程开展检测，所有检测均在配套的全自动化学发光分析仪(SMART-6500)上全自动开展。除抗dsDNA抗体的检测临界值为10 U/mL之外，其他抗体的检测临界值均为20 RU/mL。

1.3.2ELISA检测 试剂盒均严格按照说明书操作流程开展检测。血清样本按1∶201稀释，加入包被特定靶抗原的微孔板中，室温反应30 min，用清洗缓冲液清洗3次，每孔加入100 μL酶标记的抗人IgG抗体，室温反应30 min，用清洗缓冲液清洗3次，每孔加入100 μL底物液，室温反应15 min，最后加入100 μL终止液，在酶标仪中按照450和620 nm的双波长进行光密度测量。根据光密度值计算抗体浓度并判读阴阳性结果。除抗dsDNA抗体的检测临界值为100 U/mL之外，其他抗体的检测临界值均为20 RU/mL。

1.3.4线性试验 参考CLSI的EP6-A2文件[9]，分别收集略低于厂家提供的线性范围最高值的高值血清(H)和接近线性范围低值的低值血清(L)，将高、低浓度标本原液及1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32稀释液共6管进行线性范围检测，对结果进行线性回归分析，以稀释度理论值为X值、测试值为Y值分别计算直线回归相关系数R2值、r值、b值，看是否符合标准要求：r应不小于0.990 0，b在0.97～1.03范围内。

1.4统计学处理 采用SPSS21.0软件进行统计学分析。不同方法检测结果的比较，采用四格表的χ2检验，2种方法检测结果一致性的分析采用Kappa检验，一致性强度的判断：当Kappa<0.4，一致性强度较差；0.4≤Kappa<0.75，一致性一般；Kappa≥0.75，一致性良好。同时以SLE临床诊断为标准，绘制CLIA和ELISA检测抗dsDNA抗体的受试者工作特征曲线(ROC曲线)，并借助曲线下面积(AUC)比较2种方法学针对SLE疾病诊断的准确性。采用Spearman相关系数检验比较CLIA和ELISA检测抗dsDNA抗体的量值相关性。

2 结 果

2.1精密度试验 应用SMART-6500对抗ENA抗体和抗dsDNA抗体开展精密度验证，结果显示批内精密度均<7%，批间精密度检测结果均<13%。精密度试验的详细数据见表1。

2.2线性范围试验 应用SMART-6500对抗ENA抗体和抗dsDNA抗体开展线性范围验证试验，结果显示抗ENA抗体和抗dsDNA抗体在厂商推荐范围内表现出良好的检测线性，具体线性验证结果见表2。

2.3CLIA和ELISA方法学比对验证 应用SMART-6500和ELISA对329例入组样本开展抗ENA抗体和抗dsDNA抗体的平行检测，结果显示2种方法在检测抗ENA抗体和抗dsDNA抗体时均表现出良好的一致性(Kappa>0.75)。见表3。

2.4SMART-6500和ELISA检测抗dsDNA抗体的量值相关性及对SLE诊断准确性分析 由于抗dsDNA抗体量值水平与SLE疾病活动度密切相关，因此采用Spearman相关系数检验对2种方法检测量值开展相关性分析，结果显示2种方法检测量值具有显著相关性，差异有统计学意义(P<0.01)，Rho值为0.708(95%CI为0.655～0.760)，结果如图1所示。以SLE诊断作为标准，借助76例SLE样本和88例健康体检样本的检测结果绘制ROC曲线，比较2种方法检测结果对SLE疾病诊断的准确度，结果显示CLIA检测结果对于SLE的疾病诊断准确度更优于ELISA。其中，CLIA的AUC为0.986(95%CI：0.973～0.998)，而ELISA的AUC为0.907(95%CI：0.858～0.957)。结果如图2所示。

表1 应用SMART-6500检测抗ENA抗体和抗dsDNA

表2 应用CLIA检测抗ENA抗体和抗dsDNA抗体的线性范围检测结果

续表2 应用CLIA检测抗ENA抗体和抗dsDNA抗体的线性范围检测结果

表3 SMART-6500与ELISA检测抗ENA抗体和抗dsDNA抗体的符合率和一致性分析

注：-表示无数据

图1 SMART-6500与ELISA检测抗dsDNA抗体的

2.5抗dsDNA抗体项目WHO国际标准物质检测结果 2017年WHO正式发布抗dsDNA抗体国际标准物质(NIBCS代码：15/174)。该国际标准物质的标准浓度为200 U/mL。通过SMART-6500检测平台对该国际标准物质开展检测，按照标准进行换算后的浓度为24.67 U/mL。基于以上检测结果，SMART-6500平台检测结果转化为国际标准量值的转换因子为8.1。

图2 ROC曲线比较2种方法检测抗dsDNA抗体结果

3 讨 论

AID的发病机理复杂，导致其难以被诊断和防治，但大部分患者体内可检测到一种或多种高滴度的自身抗体，而且自身抗体的滴度水平对疾病进程、疗效和预后的都具有十分重要的临床意义，因此，目前自身抗体检测项目已经成为AID相关科室的常规检测项目。但国内对自身抗体的检测仍然停留在定性和半定量免疫学方法，难以满足目前临床实际需求[10]。随着临床免疫检测技术的不断发展和创新，新方法和新技术开始被应用于自身抗体检测，如液相芯片技术(MFI)、蛋白质芯片技术(PA)和CLIA等[11-14]。CLIA由于具有全自动、全定量、随机上样、灵活组合和质控更严等优势和特点，已经逐渐成为临床免疫检测领域的主流检测技术，并且在肿瘤标记物、传染病、性激素和甲状腺功能等领域发挥了重要的临床价值。近年来，CLIA方法学已逐步应用于自身抗体检测领域，极大地促进国内自身抗体检测领域向全自动、全定量、随机上样和灵活组合等方向发展，同时提升实验室自身抗体检测的质量控制水平。

但实验室在采用CLIA方法开展自身抗体定量检测前，均应严格遵循实验室质量管理控制相关要求，对定量检测平台开展相应的验证。本研究采用临床样本及WHO国际标准物质，按照CLSI EP系列文件的要求，对SMART-6500自身抗体定量检测平台开展抗ENA抗体和抗dsDNA抗体的定量检测性能验证。验证结果显示，SMART-6500具有良好的精密度和线性检测范围，完全符合临床免疫实验室针对定量检测相关性能的要求。与此同时，方法学比对试验结果也同样表明，SMART-6500与ELISA在检测抗ENA抗体和抗dsDNA抗体时均表现出良好的符合度和一致性。但由于anti-Scl-70和anti-Jo-1在临床常规检测中的阳性率偏低，因此未来仍需要进一步扩大阳性样本例数开展对比，从而获得更加科学的对比结果。

抗dsDNA抗体作为SLE疾病的标志性抗体，已经被纳入SLE相关诊断标准。该抗体的量值水平与疾病的活动度密切相关。在本研究中不仅针对抗dsDNA抗体开展了定量检测性能的验证，同时还重点比较了2种方法学检测抗dsDNA抗体的符合率、量值关系以及针对SLE的临床诊断符合率。从结果可见，2种方法学检测抗dsDNA抗体的一致性表现良好(Kappa=0.794，P<0.01)，而且检测量值也存在一定的相关性(Rho=0.708，P<0.01)。但当以SLE临床诊断结果作为标准绘制ROC曲线，比较2种方法检测结果与SLE临床诊断准确度时，结果显示SMART-6500检测结果对SLE临床诊断的准确度更高(AUC=0.986，P<0.01)。上述2种方法在检测抗dsDNA抗体的差异主要是由2种方法在抗原抗体包被及反应体系的不同所造成。在ELISA中，双链DNA抗原直接包被在聚丙乙烯微孔板上，该包被形式存在部分双链DNA结构解链为单链DNA的可能，因此可导致部分抗单链DNA抗体所引起的阳性结果。而SMART-6500则在磁微粒与抗原包被的处理上，采用的是生物素-亲和素为介导的间接包被方式。核酸类物质经过小分子生物素化后，与亲和素修饰的纳米磁微粒实现结合，实现抗原与磁珠的间接包被。双链DNA抗原间接包被不仅提高了包被效率，且实现了核酸类抗原在三维结构上的全面展现，因此检测结果对SLE的临床诊断准确度更高。

4 结 论

SMART-6500符合CLSI EP系列文件的相关定量检测性能要求，同时还具备了全自动、随机上样、检测线性范围更宽和质量控制更严等优势，因此在未来的临床实践中可作为抗ENA抗体和抗dsDNA抗体定量检测方法的选择之一。