五味沙棘泡腾片的提取工艺考察

杨静 阿古拉

【摘 要】目的：研究五味沙棘泡腾片中沙棘膏、白葡萄干、甘草、栀子的最佳提取工艺。方法：采用Agilent C18 色谱柱（250mm×4.6mm，5μm;流动相为甲醇：0.4%磷酸水溶液（65∶35），流速1mL·min-1，柱温35℃，检测波长370nm，进样10μL;综合以槲皮素、山柰素、异鼠李素的总量为指标选取最佳工艺;采用L9（34）正交实验法，优取醇提法的最佳提取方法。结果：优选出最佳提取工艺：75%乙醇，物料比为1∶8，提取1h，提取2次。槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量分别是0.427mg/g、0.370mg/g、2.833mg/g。结论：确定五味沙棘泡腾片中沙棘膏、白葡萄干、甘草、栀子的最佳提取工艺，为泡腾片剂研究和质量控制提供依据。

【关键词】五味沙棘泡腾片;槲皮素;山柰素;异鼠李素;正交实验法

【中图分类号】R284.2 【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2019）6-0020-05

五味沙棘方是蒙藏医临床常用的传统方药之一，全方由沙棘膏、木香、白葡萄干、甘草、栀子5味药组成， 沙棘膏为方中君药，含多种黄酮化合物，主要有异鼠李素、异鼠李素-3-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-β-D-芸香糖苷、槲皮素、山奈素。方中以味酸，性温，锐而有止咳、祛痰、除巴达干功效的沙棘膏为主;以排脓、祛痰的木香为辅，配以白葡萄干以清肺热、止咳、平喘，甘草以清热，止咳、祛痰，栀子以清血热为之佐使。功能主治清热祛痰、止咳定喘，临床用于肺热久咳、喘促痰多、胸中满闷等。现行2015年版《中国药典》一部收载有五味沙棘散，且其质量标准较为完善[1]，市场上已有五味沙棘颗粒、五味沙棘含片及五味沙棘口服液等，但有关泡腾片质量标准的研究尚未见报道。鉴于此将其制成迅速溶解，吸收迅速，便于患者服用的口服泡腾片剂型。蒙藏医临床常用的传统方药，采用水平正交试验法，以方中君药沙棘膏中槲皮素、山柰素、异鼠李素的总量作为提取工艺的评价指标，来优化提取工艺。

1 仪器与试药

岛津LC-20A型高效液相色谱仪（SPD-M20A二极管阵列检测器、CBM-20A型控制器、CTO-20A柱温箱、LC-20AT型输液泵、SIL-20A型自动进样器、LC solution色谱数据工作站、DGU-20A5型脱气机），电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司），旋转蒸发仪（瑞士步琦有限公司），HH-D4型数控恒温水浴锅（金坛市双捷实验仪器厂），甲醇、磷酸（天津市盛奥化学试剂有限公司）、乙醇（国药集团化学试剂有限公司），色谱甲醇（SIGMA-ALDRICH），水为超纯水，槲皮素、山柰素、异鼠李素（中国食品药品检定研究院），中药材（内蒙古天力药业有限公司）

2 方法与结果

2.1 正交试验优选提取工艺条件 由于处方中多数药材的已知有效成分在乙醇中具有较好的溶解性[2-6]。故采用单因素考察后，选用L9（34）水平正交试验，以槲皮素、山柰素和异鼠李素含量对工艺进行优化，所确定的正交因素水平见表1。

2.2 槲皮素、山柰素和异鼠李素的含量测定

2.2.1 色谱条件 采用Agilent C18 色谱柱（250mm×4.6mm），5μm;流动相为甲醇：0.4%磷酸水溶液（65∶35），流速1 mL·min-1，柱温35℃，检测波长370nm，进样10 μL。

2.2.2 供试品溶液 取五味沙棘方中除木香外的其余四味药，精密称定， 置圆底烧瓶中， 精密加入8倍量的75%乙醇， 加热回流lh，提取2次， 滤过放冷， 用旋转蒸馏仪回收乙醇后将药液定容于100mL容量瓶中备用。精密量取25mL，置具塞锥形瓶中， 加盐酸3.5mL， 加热回流水解1h， 立即冷却， 移至50mL量瓶中， 用适量75%乙醇洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加75%乙醇至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.2.3 对照品溶液的制备 精密称取槲皮素3.559mg、山柰素2.534mg、异鼠李素3.021mg分别置于100mL、100mL、10mL容量瓶中用甲醇溶解并定容，摇匀，滤过，即得对照品溶液

2.2.4 阴性对照试验 阴性对照提取液（处方中缺沙棘膏药材），按提取物测定液的制备方法制备供试液，进样测定。结果表明其色譜在槲皮素、山柰素、异鼠李素相应保留时间无峰，如图1所示。说明处方中其他成分对测定结果无干扰。

2.2.5 线性关系考察 精密吸取“2.2.3”节下混合对照品溶液1、2、5、10、15、20μL，注入高效液相色谱仪，按“2.2.1”节下色谱条件进行测定，以进样量对峰面积积分值进行回归分析，所得结果见表2，3种黄酮在所测定范围内呈良好的线性关系。

2.2.6 精密度试验 精密吸取标准品溶液10μL进样，按2.2.1项下重复进样6次，测得槲皮素、山柰素和异鼠李素的峰面积积分值，计算RSD分别为0.65%、0.74%、0.86%。表明方法精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 取提取液测定液，按0、2、4、6、8h不同时间间隔进样，测得槲皮素、山柰素和异鼠李素的峰面积积分值，计算RSD分别为1.03%、1.15%、1.52%，结果表明提取物测定液中槲皮素、山柰素和异鼠李素在8h内稳定。

2.2.8 重复性试验 分别称取样品5份，按供试品溶液制备方法平行制备5份溶液，进样10μL，测定峰面积，连续进样2次，计算槲皮素、山柰素、异鼠李素含量的RSD分别为0.77%、0.57%、0.77%。结果表明本方法重复性良好。

2.2.9 回收率试验 精密称取已测知含量的五味沙棘提取物的样品，分别加入不同质量的槲皮素（见表3）山柰素（见表4）异鼠李素（见表5）对照品，按样品溶液的制备方法制备样品，测定其含量，计算回收率。

2.10 提取物含量测定 精密吸取正交试验各试验号提取液测定液10μL，按上述色谱条件依次进样，测定槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积积分值如图1所示;经计算槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量见表6。

2.3 试验结果分析 采用综合平衡法对试验结果进行极差分析和方差分析（SPSS统计软件），结果见表6、表7。由表6中的R值可知，以槲皮素、山柰素、异鼠李素的总含量为指标时，影响因素的大小顺序均为A>C>D>B。说明溶剂浓度和提取时间是重要因素，提取次数和溶剂倍数次之。由方差分析结果可知，因素A、C对总含量的影响均有显著性。结合极差分析，并按生产实际中降低消耗，提高效率的原则，确定五味沙棘泡腾片较优的提取工艺条件为A2B3C1D2，即加入75%乙醇8倍量，提取2次，每次1h。

2.4 提取工艺的验证 按上述较优的工艺进行试验验证（n=6），结合槲皮素、山柰素、异鼠李素总含量的平均值为3.6300mg/g，表明所确定的较优工艺合理可行。

3 讨论

考虑到槲皮素、山柰素、异鼠李素的化学性质，在进行提取工艺条件的考察时，采用了65%乙醇、75%乙醇、85%乙醇 、95%乙醇作为溶媒进行回流提取。结果表明，75%乙醇较优，考虑到浓度为影响因素，故以70%、75%、80%为提取溶剂浓度进行正交试验考察。根据文献报道沙棘膏中黄酮类化合物大多数以糖苷的形式存在，主要以槲皮素苷、山柰素苷、異鼠李素苷。如果直接测槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量发现及其低，难以反映黄酮类化合物的真实含量，因此试验中采取酸水解后测定槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量。为了尽可能短时间内获得较好的分离效果，对色谱条件进行优化，考察了不同组成的流动相，如乙腈—水、甲醇—水、甲醇—酸系统，酸比较了磷酸和冰醋酸。结果表明磷酸可以减少色谱峰拖尾，使色谱峰达到较高的对称性，改善了分离度，最终确定下条件为甲醇—0.4%磷酸水溶液为流动相，峰形对称，无拖尾现象，槲皮素保留时间为14min左右，山柰素保留时间为23min左右，异鼠李素保留时间在27min左右。

4 小结

在五味沙棘泡腾片的研制过程中，根据方中各味药材中主要有效部位或有效成分的理化性质，确实了五味沙棘泡腾片的工艺路线。采用正交试验法对醇提工艺进行优化，以槲皮素、山柰素和异鼠李素的总量为指标，优选了最佳煎煮工艺条件。通过剂型改进，对全粉末的五味沙棘散中全部药材进行了提取，减少了服药量，有助于有效部位或有效成分的溶出和吸收，加快了药品的起效速度，同时便于服用、携带和贮藏，为患者提供了一种全新的给药选择方案。

对于蒙药的标准建立为今天蒙医药的发展奠定坚实的理论基础，从而强化蒙医药在防病、治病、保护和增进人民群众的健康事业中发挥独特的、重要的和不可替代的作用，从而形成保持蒙医药特色的标准体系，建立规范的、科学的蒙药材内在的质量控制体系，保证蒙药制剂的质量。

参考文献

[1]中华人民共和国国家药典委员会.中国药典[S].北京：中国医药出版社，2015：616.

[2]李亚真.沙棘膏制备过程中黄酮类成分及抗氧化活性的变化研究[J].华西药学杂志，2014，29（4）：407-409.

[3]游剑，邓青云，高丽，等.不同工艺对栀子苷提取效果的比较研究[J].江苏农业科学，2012，40（1）：220-222.

[4]胡震，杨广德，罗国安，等.栀子中栀子苷提取工艺及HPLC分析[J].中成药，2006，28（3）：336-338.

[5]王振辉，李超生，王海森，等.甘草苷提取工艺正交试验优化[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（10）：30-32.

[6]魏宁，郎伟君.甘草中甘草酸和甘草苷的提取工艺研究[J].哈尔滨商业大学学报（自然科学版），2015，（2）：143-145.

（收稿日期：2019-01-07 编辑：程鹏飞）