分泌性中耳炎患者耳积液中miR-146a和miR-155的表达研究 ???

王庆亮 徐锦

【摘要】目的 探讨分泌性中耳炎（SOM）患者耳积液中微小核糖核酸-146a（miR-146a）和miR-155的表达及临床意义。方法 58例SOM患者作为研究对象（SOM组），另选取30名体检健康者作为对照组。应用实时荧光定量PCR法检测2组血浆及SOM组耳积液miR-146a和miR-155表达情况，应用ELISA检测2组血浆及SOM组耳积液IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平，并对miR-146a、miR-155与辅助性T淋巴细胞1（Th1）、Th2细胞比例以及Th1/Th2进行相关性分析。结果 与对照组相比，SOM组血浆、耳积液中miR-146a、miR-155、CD4+ Th1、CD4+ Th2、Th1/Th2、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IFN-γ/IL-4均升高（P均< 0.05）;与SOM组血浆值相比，SOM组耳积液中miR-146a、miR-155、CD4+ Th1、CD4+ Th2、Th1/Th2、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IFN-γ/IL-4表达水平均升高（P均< 0.05）;Pearson相关分析显示：SOM组患者耳积液miR-146a、miR-155水平与CD4+ Th1细胞比例、CD4+ Th2细胞比例、Th1/Th2均呈正相关，耳积液miR-146a、miR-155表达与IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10呈正相关。结论 SOM患者耳积液中miR-146a和miR-155高表达，miR-146a、miR-155可能通过影响Th1/Th2平衡而促进炎症进展。

【關键词】 分泌性中耳炎;微小核糖核酸-146a;微小核糖核酸-155;耳积液

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression levels and clinical significance of microRNA-146a （miR-146a） and microRNA-155 （miR-155） in the ear effusion of patients with secretory otitis media （SOM）.  Methods A total of 58 SOM patients were assigned into the SOM group， and 30 healthy subjects were recruited into the control group. The expression levels of miR-146a and miR-155 in the plasma between two groups and in the auricular effusion in the SOM group were quantitatively measured by real-time fluorescence quantitative PCR. The expression levels of interleukin-2 （IL-2）， interferon-γ（IFN-γ）， interleukin-4 （IL-4） and interleukin-10 （IL-10） in the plasma between two groups and in the auricular effusion in the SOM group were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The correlation between miR-146a， miR-155， Th1 and Th2 proportion and Th1/Th2 was analyzed.  ResultsCompared with the control group， the expression levels of miR-146a， miR-155， CD4+ Th1， CD4+ Th1， Th1/Th2， IL-2， IFN-γ， IL-4， IL-10， IFN-γ/IL-4 were significantly up-regulated in the SOM group （all P < 0.05）. Compared with plasma expression of the SOM group， the expression levels of miR-146a， miR-155， CD4+ Th1， CD4+ Th2， Th1/Th2， IL-2， IFN-γ， IL-4， IL-10， IFN-γ/IL-4 in the auricular effusion were up-regulated （all P < 0.05）.Pearsons correlation analysis demonstrated that the expression levels of miR-146a and miR-155 were positively correlated with the proportion of CD4+ Th1， CD4+ Th2 and Th1/Th2. The expression levels of miR-146a and miR-155 were positively correlated with IL-2， IFN-γ， IL-4 and IL-10 in the auricular effusion.  Conclusions The miR-146a and miR-155 are highly expressed in the ear effusion of SOM patients. The miR-146a and miR-155 can promote the progression of inflammation probably by affecting the balance of Th1/Th2.

【Key words】Secretory otitis media;Micro RNA-146a;Micro RNA-155;Ear effusion

分泌性中耳炎（SOM）是耳鼻喉科常见疾病之一，以中耳积液及听力下降为主要特征，可造成患者听力损伤，影响语言发展，甚至永久性失聪[1-2]。由于耳痛不明显，至听力受影响才就诊，多延误最佳治疗时机。有研究表明，辅助性T淋巴细胞1（Th1）/Th2失衡可能是引起SOM的原因之一[3]。而微小RNA-146a（miR-146a）、miR-155已被证实在某些免疫性炎症疾病或炎性环境中过表达，但miR-146a、miR-155在分泌性中耳炎中表达以及与Th1/Th2平衡的关系研究者较少[4-5]。本研究主要比较SOM患者血浆、耳积液与健康者血浆中miR-146a、miR-155水平，并分析miR-146a、miR-155与Th1/Th2相关性，为SOM发病机制提供理论依据。

对象与方法

一、研究对象

选取2016年9月至2018年9月于本院耳鼻喉科就诊的SOM患者58例作为研究对象，其中男27例、女31例，年龄（36.28±4.39）岁;单耳积液33例，双耳积液25例;黏液性28例，浆液性30例。纳入标准：有明显听力减退者;发病时间≥21 d;经临床检查、鼓气耳镜检查、声导抗测试、电测听及诊断性鼓膜穿刺确诊SOM。排除标准：合并鼻咽部肿瘤、鼻咽癌或鼻咽部占位性病变等;合并全身系统系疾病;中途退出研究者。另选取同时期体检健康者30名，排除SOM病史，经体检者同意收集血浆标本作为对照。其中男13例、女17例，年龄（36.37±4.42）岁。本研究经医院伦理委员会同意，患者均签署知情同意书。

二、方 法

1.样本收集

血浆标本：所有研究对象于晨起空腹抽取肘静脉血5 ml置于装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管中，平均分成2份，1份3 000转/分 -4℃离心20 min，取上清置于-80℃冰箱保存，现用现融，另1份直接置于-80℃冰箱保存。

耳积液标本：SOM患者外耳道经常规消毒，鼓膜表面麻醉，无菌条件下于鼓膜前下象限穿刺抽取耳积液0.1 ml，封口标记，置于-80℃冰箱保存，以供后续使用。

2.实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测血浆、耳积液中miR-146a和miR-155表达

采用qRT-PCR法测定对照组血浆、SOM组血浆、耳积液中miR-146a和miR-155表达情况。取上述血浆、耳积液样本，按照Trizol LS（赛默飞世尔科技）试剂盒说明书操作提取血清总RNA，按照Bio Rad逆转录试剂盒（赛默飞世尔科技）操作步骤将2 μgRNA逆转录为cDNA，之后按照SYBR Green PCR master mix试剂说明配反应体系并加样。qRT-PCR反应体系共为20 μl：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10 μl，cDNA 2.0 μl，上下游引物各0.8 μl，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μl，双蒸水 6.0 μl。完成后将其放入荧光定量PCR仪上进行反应，程序设定为：95℃预热1 min，95℃ 15 s，

60℃ 30 s，72℃ 15 s，以上三步骤共循环40次。miR-146a和miR-155均以U6为内参基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物设计见表1。反应结束后对Ct值进行数据分析，采用2-ΔΔCt法计算miR-146a和miR-155相对表达量。

3.流式細胞术检测研究对象外周血CD4+细胞Th1、Th2细胞比例

取抗凝静脉血，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，3 000转/分离心30 min，上中层交界处为淋巴细胞、单核细胞混合液，3 000转/分离心30 min，保留沉淀为单核细胞，均加入异硫氰酸荧光素（FITC）标记的鼠抗人CD4单克隆抗体20 μl，避光培育15 min，分别添加藻红蛋白（PE）标记的IFN-γ抗体、IL-4抗体20 μl，避光培育30 min，离心后弃上清，置于流式细胞仪下检测Th1、Th2细胞比例。上机前常规对流式细胞仪进行检测，控制仪器各项指标在质控允许值内，每份检测标本获取设门内10 000个细胞，检测后所得数据以Listmode文件形式保存。

4.细胞因子检测

取血浆、耳积液标本置于冰上解冻，恢复室温后采用ELISA试剂盒检测其中IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-10水平，检测试剂盒分别为人IL-2 ELISA试剂盒（上海钰博生物科技有限公司）、IFN-γELISA试剂盒（上海齐一生物科技有限公司）、人IL-4 ELISA试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司）、人IL-10 ELISA试剂盒（上海康朗生物科技有限公司）。严格参照试剂盒操作说明书进行操作。

三、统计学处理

采用SPSS 17.0进行数据分析，计量资料符合正态分布的均以表示，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对t检验，通过Pearson法进行相关性分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、SOM组和对照组miR-146a和miR-155水平比较

与对照组相比，SOM组血浆、耳积液中miR-146a、miR-155表达水平均升高（P均< 0.05）;与SOM组血浆中miR-146a、miR-155表达水平相比，耳积液中miR-146a、miR-155表达水平均升高（P均< 0.05），见表2。

二、SOM组和对照组CD4+细胞Th1、Th2细胞比例、Th1/Th2比较

与对照组相比，SOM组血浆、耳积液中CD4+ Th1比例、CD4+ Th2比例、Th1/Th2表达水平均升高（P均< 0.05）;与SOM组血浆标本相比，SOM组耳积液中CD4+ Th1比例、CD4+ Th2比例、Th1/Th2表达水平均升高（P均< 0.05），见表3。

三、SOM组和对照组IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平比较

与对照组相比，SOM组血浆、耳积液中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IFN-γ/IL-4均升高（P均< 0.05）;与SOM组血浆标本相比，SOM组耳积液标本中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IFN-γ/IL-4均升高（P均< 0.05），见表4。

四、SOM组耳积液miR-146a、miR-155与CD4+ Th1、CD4+ Th2细胞比例、Th1/Th2及细胞因子相关性分析

Pearson相关分析显示，SOM患者耳积液中miR-146a、miR-155表达与CD4+ Th1细胞比例、CD4+ Th2细胞比例、Th1/Th2、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10均呈正相关（P均< 0.05），见表5。

讨论

SOM主要表现为中耳积液及听力下降，大部分患者可自愈，或经治疗后好转，但仍有10%左右患者发展为慢性中耳炎且反复发作，严重影响患者生存质量。目前关于SOM的病因及发病机制尚不完全清楚。有研究表明，咽鼓管功能障碍、感染、自身免疫疾病等均可造成SOM[7]。随着免疫学的深入研究，Th1/Th2失衡在诸多炎性疾病中发挥作用[3]。微小核糖核酸是机体非编码微小RNA，可通过调节靶基因mRNA的翻译以及翻译后转录调控靶基因的蛋白表达，在炎性疾病中发挥重要作用。有报道称，miR-146a、miR-155参与炎症反应，但miR-146a、miR-155在SOM中以及与Th1/Th2关系尚不清楚[4-5]。

miR-146a是由miR-146经加工后产生的，位于5q34[8]。研究表明，miR-146a可介导炎症反应[9-11]。

本研究中，SOM患者血浆中miR-146a水平显著高于健康对照者血浆中含量，提示miR-146a水平可能与SOM的发病密切相关，而SOM患者耳积液中miR-146a表达量又显著高于患者血浆中含量，提示耳积液中miR-146a水平对SOM的发病更为敏感。miR-155是一个典型的多功能微小RNA，位于非编码区基因BIC内，在免疫、炎症的调控中发挥重要作用[12-13]。谭玉军等[14]研究表明，miR-155在脂多糖诱导的RAW2647巨噬细胞炎症反应中高表达，而巨噬细胞发挥促炎作用也是引起SOM的重要因素，据此猜测，miR-155可能在SOM患者耳积液中也有类似表达。本研究中，健康对照者血浆、SOM患者血浆、SOM患者耳积液中miR-155水平依次升高，提示miR-146a水平升高可能與SOM的发病密切相关，且SOM患者耳积液较血浆更能体现SOM病情严重程度。

Th细胞间的平衡状态与多种疾病的发生发展密切相关[15]，Th1细胞主要介导细胞免疫应答，分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子，促进细胞毒T细胞的杀伤作用，激活巨噬细胞杀灭细胞病原体[16]。Th2主要介导体液免疫，分泌IL-4、IL-10等细胞因子，抑制细胞免疫应答，使Th1、Th2处于免疫平衡状态，集中力量清除外来抗原，是体内体液免疫及细胞免疫间重要的调节枢纽，Th1/Th2失衡则导致各种炎症发生[17-18]。本研究中，SOM患者血浆、耳积液中CD4+ 细胞中Th1细胞比例、Th2细胞比例均显著高于健康对照者血浆中含量，与Th1细胞相比，Th2细胞增长幅度较少，导致Th1/Th2升高。同时Th1相关细胞因子IL-2、IFN-γ以及Th2相关细胞因子IL-4I、L-10水平显著升高，提示SOM患者存在较为复杂的炎症反应，促炎因子与抑炎因子均大量产生。此外，IFN-γ/IL-4显著升高，提示SOM患者Th1/Th2失衡，呈Th1优势。本研究进一步表明，SOM患者血浆、耳积液中miR-146a、miR-155与Th1细胞比例、Th2细胞比例、Th1/Th2以及细胞分泌因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10呈正相关，推测miR-146a、miR-155可能通过影响Th1/Th2平衡参与SOM发生发展进程，但miR-146a、miR-155如何影响Th1/Th2平衡机制还有待进一步研究。本研究也存在一定不足，因为Th1、Th2并没有标志性的抗体，本研究用IFN-γ、IL-4分别代表Th1、Th2细胞比例，但IFN-γ、IL-4并非只由CD4+ 细胞产生，CD8+等T细胞亦可产生，只能代表一种趋势。

综上所述，SOM患者耳积液中miR-146a、miR-155高表达，可能通过影响Th1/Th2平衡参与SOM发病过程。

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（收稿日期：2019-03-18）

（本文編辑：杨江瑜）