水产品中有机磷农药多残留的固相萃取-气相色谱串联质谱测定

叶茂盛，孙秀梅，郝 青，金衍健，胡红美，郭远明，应忠真，王范盛

（浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江舟山 316021）

我国的农药的使用一直是一个被大众关注的问题，各类农药通过环境迁移、地表径流等方式污染养殖或捕捞水域，部分农药则广泛应用于水产养殖中的清塘和病虫害防治，甚至水产品的加工过程中也出现了非法使用农药等现象。有机磷农药对细菌、害虫、杂草生长等具有有效的控制，能提高农作物的产量，曾被广泛使用[1]，为研究有机磷农药残留对水产品质量安全的影响，加强水产品中多种有机磷农药检测方法的研究，特别是建立快速、准确、可操作性强、对环境污染小的分析方法具有现实应用意义。

检测方法方面，目前国内的有机磷农药检测有气相色谱法（GC）[2-4]、气相色谱质谱法（GC/MS）[5-7]、高效液相色谱（HPLC）[8-9]和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[10-11]。余骏等[12]检测水产品中有机磷农药残留时，将样品用丙酮提取、弗罗里硅土净化后，进行DB-1701毛细管色谱柱分离用火焰光度检测器直接测定，建立了气相色谱法测定水产品体内乐果、甲基对硫磷和马拉硫磷残留量的方法。张云等[13]采用酸化的乙酸乙酯提取等量后的样品，将提取液过酸性氧化铝柱从而去脂，EI源，正离子多反应检测模式检测，外标法定量，使用高效液相色谱-串联质谱仪同时检测水产品样品中的敌百虫、敌敌畏、蝇毒磷、乙酰甲胺磷、甲胺磷、毒死蜱、乐果等7种有机磷类药物的残留量。牛佳钰等[14]不仅简单的阐述了有机磷农药残留对环境的污染以及对人体健康的危害，还提出一些常用的农药检测方法，例如高效液相色谱法、气相色谱法、薄层层析法、荧光光度法、免疫测定法以及电化学方法等。自从ERCEGOVICH，et al[15]和HAMMOCK，et al[16]提出利用免疫学技术进行农药残留分析以来，国外近年来在此方向的研究比较活跃，尤其是酶联免疫分析，该法测定的水中有机磷农药残留限可达0.1～10 mg·L-1。CLGG，et al[17]采用液相色谱和酶联免疫分析两种方法检测了草甘磷的残留。有机磷农药检测方法相对成熟，目前主要在前处理部分仍存在试剂消耗量大、操作过于繁杂、回收率不高等问题需要改善，本文主要通过比较几种不同提取剂（乙腈，正己烷，正己烷：乙酸乙酯=1：1混液）和不同吸附剂（PSA，弗罗里硅土，中性氧化铝）对水产品的净化效果的影响，采用固相萃取-气相色谱串联质谱测定，建立了一种更简便，提取效果更好的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用大黄鱼Larimichthys crocea、南美白对虾Penaeus vannamei、草鱼Ctenopharyngodon idellus、鲤鱼Cyprinus carpio、鲫鱼Carassius auratus来自舟山当地农贸市场。正己烷、乙腈、乙酸乙酯、丙酮（色谱纯）、氯化钠（分析纯）、N-丙基二乙胺（PSA）（分析纯）、弗罗里硅土 Florisil（100～200 目）、氧化铝 Alumina-N（100～300 目）。

28种有机磷标准溶液（甲胺磷、敌敌畏、乙酰甲胺磷、氧化乐果、灭线磷、硫线磷、甲拌磷、乐果、特丁硫磷、地虫硫磷、磷胺、二嗪磷、甲基对硫磷、皮蝇磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、倍硫磷、毒死蜱、对硫磷、水胺硫磷、喹硫磷、杀扑磷、苯线磷、丙溴磷、三唑磷、亚胺硫磷、伏杀磷、蝇毒磷）。

1.2 仪器与设备

气相色谱-质谱联用仪（Agilent 7890B-7000C 型），涡旋振荡器（IKA MS3），旋转蒸发器（Buchi R-215），台式离心机（Eppendorf centrifuge5810），超声波清洗机（KUDOS）；分析天平；烘箱。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

1.3.1 .1有机磷样品萃取

在装有5.0 g水产品试样的离心管中加入10 mL提取剂（正己烷，乙腈，乙腈：乙酸乙酯=1：1混合溶液，乙腈：水=9：1溶液，正己烷：乙酸乙酯=1：1混合溶液），通过涡旋振荡器震荡2 min，使用超声仪超声5 min，以5 000 r·min-1的转速离心5 min，将上层清液转移至旋蒸瓶中，再重复上述操作，将上层清液合并，在40℃水浴旋蒸仪中浓缩至干，加入1 mL正己烷定容。

1.3.1 .2样品净化

将定容后的溶液通过固相萃取的方式净化，将硅胶固相萃取柱中加入1.0 g PSA，使用适量的正己烷：乙酸乙酯：丙酮（8：1：1）活化（观察萃取柱的活化状态，必要时增加洗脱液体积），活化萃取柱后接上旋蒸瓶，将浓缩的提取液转移至萃取柱中，加入10 mL洗脱液（正己烷：乙酸乙酯：丙酮=8：1：1）进行洗脱。将收集到的洗脱液再次使用旋转蒸发仪在40℃水浴旋蒸仪中浓缩至干，加入1 mL正己烷定容，使用涡旋振荡器振荡确保洗脱液能充分溶解在正己烷中，将定容后的溶液收集于1 mL气相小瓶备用。

1.3.2 气相色谱-串联质谱分析条件

1.3.2 .1色谱条件

色谱柱为DB-1701毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 um）；色谱柱升温程序：70℃保持2 min，以 25℃·min-1升到150℃，再以3℃·min-1升到200℃，再以8℃·min-1升到280℃保持10 min；进样口温度：290℃；进样量为1 uL；进样方式：脉冲不分流方式进样。

1.3.2 .2质谱条件

离子源：电子轰击离子（EI）源；离子源温度：300℃；四极杆温度：150℃；GC-MS/MS接口温度：280℃；溶剂延迟时间：5 min；碰撞气流速：1.5 mL·min-1，淬灭气流速：2.25 mL·min-1。采用多反应检测（MRM）模式。

1.3.3 标准曲线的绘制

分别吸取一定量的标准溶液，用正己烷稀释，配置成浓度为 5、10、20、40、100、200 μg·L-1的标准溶液，按1.3.2节的条件测定。以各农药的浓度为横坐标（x），以其对应的峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 提取剂的选择与优化

水产品中含有大量脂肪，丰富的氨基酸和蛋白质，选取合适的提取剂既能减少杂峰对实验结果的干扰，也能减少对色谱柱的污染损害，延长色谱柱的使用寿命。本研究分别选用了正己烷，乙腈，乙腈：乙酸乙酯=1：1混合溶液，乙腈：水=9：1溶液，正己烷：乙酸乙酯=1：1混合溶液作为提取剂对同种样品进行提取，用硅胶柱净化，通过气质联用仪测定并分析。实验中用乙腈二次提取的溶液十分浑浊，且离心管口出现了大量样品絮状物，这是因为100%浓度的乙腈溶液会使水产品中的蛋白质快速变性导致蛋白质迅速凝聚包裹了目标药物，使药物难以被提取，导致回收率出现偏低的情况，同时浑浊的情况也使后续的固相萃取变得难以操作，加大了对实验的干扰。王雪荣[18]通过实验测定出了合适的乙腈浓度为90%。本实验则继续尝试其他提取剂的比较。用乙腈：乙酸乙酯=1：1混合溶液，乙腈：水=9：1溶液提取后的提取液均难以通过硅胶柱。结果表明：使用正己烷或正己烷：乙酸乙酯=1：1混合溶液的提取效果更好，基线更稳定，回收率更高。正己烷和乙酸乙酯都是低毒性有机溶剂，为了简化操作难度及步骤，故后续实验选择正己烷作为提取剂。

2.2 吸附剂的选择与优化

提取剂未经过净化时，基质存在很多杂峰，会对有机磷的测定造成极大的干扰。采用不同的吸附剂材料对提取液进行净化，会取得不同的效果。PSA可去除各种糖类、脂肪酸、有机酸、酚类和亲脂性色素等极性物质，并能螯合大多数金属离子；弗罗里硅土适合从非极性基质中吸附极性化合物；中性氧化铝适用于对碱性物质的分离，也可以用来分离弱的有机酸和碱等[19]。本研究用正己烷作为提取剂，在硅胶柱中分别加入等量的（1 g）PSA，弗罗里硅土，中性氧化铝对提取液进行净化处理，净化处理后的溶液通过气质联用仪测定并进行比较分析。结果表明：使用PSA作为吸附剂的净化效果更好，可获满意的回收率，且重现性较好，其次是弗罗里硅土，中性氧化铝的除杂能力明显不如PSA和弗罗里硅土。故本研究采用PSA作为吸附剂。

2.3 质谱条件的优化

对28种农药的前级离子、产物离子、碰撞能量等一系列质谱参数进行了优化。首先选择前级离子，对每一种农药以适量的浓度进行全扫描，并从一级质谱图中选择适当的离子作为前级离子；其次选择产物离子，对选定的前级离子用产物离子扫描的方式确定二级质谱图，从中选择适宜的离子作为产物离子；经优化的气相色谱质谱条件分析得到28种有机磷的均得到较好的分离如图1所示。对每一组前级离子/产物离子分别选择不同的碰撞能量进行扫描，最终获得MRM扫描的监测离子如表2所示。

图1 28种有机磷农药标准溶液的气相色谱质谱图Fig.1 Gas chromatography-mass spectrometry of 28 standard solutions of organophosphorus pesticides

2.4 方法的线性关系和定量限

使用建立的方法对28种有机磷农药在大黄鱼和南美白对虾中进行线性关系和定量限的研究。结果如表2所示，在5～200 μg·L-1范围内，28种有机磷农药的峰面积与对应的质量浓度间呈良好的线性关系，相关系数R2＞0.996 8，以被测物质的定量离子对的信噪比为10确定定量限在0.2～7.9 μg·kg-1之间，符合农药残留分析方法的要求[20]。

2.5 方法的回收率和精密度

在水产试样中添加100 μg·kg-1的28种农药混合标准溶液，按照1.3.1节方法进行处理做回收率试验，每个水平平行测定6次计算精密度，结果如表2。结果表明，28种有机磷农药在大黄鱼中的平均回收率在67%～99%之间，相对标准偏差在5.3%～13.6%（n=6）之间，在南美白对虾中的平均回收率为73%～106%，相对标准偏差在4.6%～12.8%（n=6）之间。

表2 28种农药的各项参数及在大黄鱼和南美白对虾中的平均添加回收率及相对标准偏差Tab.2 Parameters of 28 pesticides and average addition recovery and relative standard deviation in large yellow croaker and white shrimp

3 结论

通过对样品提取步骤和净化步骤的优化，本研究建立了水产品中28种有机磷农药的固相萃取-气相色谱串联质谱检测方法。样品经过正己烷均质提取，PSA联合硅胶柱净化后GC-MS/MS分析，杂质含量显著降低，灵敏度显著提高，该方法较为灵敏、准确、简便，可用于水产品的有机磷农药残留情况检测。