浙江沿岸髭缟虾虎鱼的系统地理分析

杨开荣，毛君来，顾翠平，陈永久,

（1.浙江海洋大学国家海洋设施养殖工程技术研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大学海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022）

髭缟虾虎鱼Tridentiger barbatus隶属于虾虎鱼科Gobiidae、缟虾虎鱼属Tridentiger。因下颌长有胡须，又称须缟虾虎鱼。成鱼体侧扁，背缘广弧形隆起；头大平扁，头部有许多触须，穗状排列。眼小，口大，前位。头部无鳞，体被栉鳞[1]。髭缟虾虎鱼是近海底层温暖性小型鱼类，广泛分布于中国、朝鲜半岛、日本及菲律宾沿岸海域，常栖息于河口咸淡水域，有时也进入江、河下游淡水水域中生活，主要以牡蛎贝类、小型鱼类、枝角类及其他水生昆虫为食。髭缟虾虎鱼是浙江沿岸常见的种类[2]。由于髭缟虾虎鱼个体小，因此食用价值和经济价值不显著，但可用于指示环境，是研究群体遗传结构和系统地理的理想生物学模型。

鱼类线粒体DNA标记，如细胞色素c氧化酶第一亚基（COI）结构简单、长度适宜，已经被广泛应用于物种鉴定、系统地理以及遗传多样性研究[3]。COI基因序列在很大程度上弥补了形态学鉴定的不足，为新物种和遗传多样性的鉴定提供了有力的技术支持。基于线粒体COI序列多态，于亚男等[4]对长江口7种虾虎鱼进行了系统分类，顾翠平等[5]报道了浙江沿岸斑尾刺虾虎鱼Acanthogobius ommaturus的分类与遗传关系。本文通过对髭缟虾虎鱼COI DNA序列分析，旨在探索浙江沿岸髭缟虾虎鱼群体遗传多样性与系统地理关系，为下一步浙江沿岸髭缟虾虎鱼及其它鱼类物种保护措施的实施，以及海洋生态环境的评估提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样本和保存

髭缟虾虎鱼样本于 2012年7月-2015年10月期间分别采自舟山嵊泗、舟山岱山、宁波象山、台州临海、温州洞头和温州苍南6个点的潮间带水域，采样点的地理位置如图1所示。样本收集主要采用网捞与手抓的方式。共采集41个髭缟虾虎鱼样本，样本数量分布如表1。样本置于95%乙醇中并保存于-20℃冰箱中以备用。

采样点地理分布从北至南依次为嵊泗、岱山、象山、临海、洞头和苍南。

图1 髭缟虾虎鱼采样地点分布图Fig.1 Map shows sampling sites of T.barbatus

1.2 DNA的提取、扩增及测序

每个样本剪取0.5～1 cm新鲜或冷冻组织进行基因组DNA提取，使用Promega公司Wizard Genomic DNA Purification Kit试剂盒进行抽提。DNA沉淀、干燥处理后，溶于200 μL DNA Rehydration Solution中。DNA扩增引物采用硬骨鱼类COI通用引物 Fish1F和Fish1R[3]；引物由上海生工生物股份有限公司合成。PCR在一个25 μL的反应体系中进行，包括12.5 μL TaqMix，1 μL正向引物，1 μL反向引物，9.5 μL灭菌双蒸水，1 μL模板DNA。PCR反应程序为95℃预变性2 min，95℃变性40 s，52℃退火60 s，72℃延伸90 s，共35个循环，72℃最后延伸5 min。琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，凝胶成像仪扫描记录结果，结果单一明亮的PCR产物送上海生工生物股份有限公司测序。

表1 浙江沿岸髭缟虾虎鱼样本采集与COI DNA序列变异信息Tab.1 Information of COI DNA sequence variation in T.barbatus from the coastal sea of Zhejiang

1.3 DNA序列数据的处理

采用Clustal X 2.0[6]和BioEdit v.7.0.9.0[7]软件对所测的序列进行同源序列比对、排序。利用DnaSP5.10[8]计算序列的单倍型数目、单倍型多态性（Hd）及核苷酸多态性（π）。利用Network4.6[9]构建单倍型网络关系图。采用MEGA6.0[10]构建邻接（NJ）聚类树。最后，采用 Arlequin 3.5软件[11]进行分子方差分析（AMOVA）、并计算采样点之间的FST值。

2 结果

本文共获得41条长度为579 bp的线粒体DNA COI序列，并鉴定出11个单倍型。单倍型之间碱基替换为1～5个。H01是最常见单倍型，占总数的56.1%，被23个样本分享，分布于6个采样点；H02分布于除象山之外的5个采样点；洞头、临海分享了H03；H06和H07仅分布在嵊泗；H08和H09仅分布在岱山；H10只分布在象山；H11只分布在苍南。详细如表1所示。单倍型多态性与核苷酸多态性在嵊泗最高（Hd=0.90±0.16；π=0.003 1±0.000 7），在临海最低（Hd=0.57±0.13；π=0.001 3±0.000 4）。单倍型网络图呈辐射状（图 2a），以H01和H02为中心，通过1～3个碱基替换与其它所有单倍型相连接；NJ聚类树显示6个采样点髭缟虾虎鱼单倍型没有形成与地理相关的类群（图 2b）。

图2 髭缟虾虎鱼COI DNA单倍型网络图（a）和NJ聚类树（b）Fig.2 T.barbatus COI DNA haplotype network（a）and NJ tree（b）

6个采样点之间的遗传差异（FST指数）为-0.143～0.198，其中嵊泗与临海采样点之间遗传差异指数最大，为 0.198（0.05＞p＞0.01），其次为嵊泗与洞头，为 0.146（p＞0.05），其余几乎无差异，具体如表2。此外，分子方差分析（AMOVA）显示种群间变异率为较小，即3.11%（d.f.=5），而种群内变异率高达 96.89%（d.f.=35）。

表2 不同采集地点髭缟虾虎鱼样本的遗传差异指数（FST）Tab.2 The population genetic differentiation index（FST）of T.barbatus among different sampling locations.

3 讨论

遗传多样性是生物多样性的核心，也是生物进化的基础[12]，遗传多样性的高低与物种的适应能力有密切的关系。单倍型多态性（Hd）和核苷酸多态性（π）是反映种群遗传多样性的重要指标。本研究发现髭缟虾虎鱼种群具有单倍型多态性高和核苷酸多态性低的特点，这类情况在我国及邻近海域的海洋鱼类中普遍存在，如双带缟虾虎鱼Tridentiger bifasciatus[13]、大泷六线鱼Hexagrammos otakii[14]。本研究中髭缟虾虎鱼的π值为0.001 3～0.003 1，低于其它众多海洋鱼类。这一点在YU Ziniu，et al[15]发表的关于黄海与东海日本鳀Engraulis japonicus的文章中得到了证实（平均π值=0.006 4）；此外，LYNCH，et al[16]报道，美国大西洋沿岸的大西洋油鲱Brevoortia tyrannus的平均π值为0.027 4。一般来说，单倍型多态性和核苷酸多态性数值越大，种群遗传多样性越丰富[17-18]，其有效群体也越大，并且物种对环境变化的适应潜力也越大。

本文结果显示浙江沿岸髭缟虾虎鱼的单倍型多态性与核苷酸多态性在嵊泗最高（Hd=0.90±0.16；π=0.003 1±0.000 7），在临海最低（Hd=0.57±0.13；π=0.001 3±0.000 4）。推测这可能与嵊泗列岛栖息地生态环境多样性，或者较少人为活动干扰有关；临海髭缟虾虎鱼的遗传多样性较低，可能是该地区受到了较多人为因素的干扰。这也表明该地区的髭缟虾虎鱼种质资源状况不容乐观。建议应采取一定措施，如沿海作业管控等对该地区进行种质资源的保护，以提高髭缟虾虎鱼的遗传多样性。此外，由于本次COI分析的髭缟虾虎鱼的样本数比较少，因此后续应扩大样本容量，以便做进一步的验证分析。

单倍型网络图，还有NJ聚类关系、AMOVA和FST分析结果一致表明，浙江沿岸髭缟虾虎鱼地理群体间差异不大，没有严格形成与地理水文特征相符合的系统地理结构。初步推断有两种可能：（1）不同群体间的隔离时间不久；（2）该海域没有显著的基因流障碍。此外，台湾暖流与沿岸入海径流的交汇，有助于海洋鱼卵、幼体及成体的扩散，导致了髭缟虾虎鱼没有显著的系统地理分化。这一点与顾翠平等[5]在浙江沿海斑尾刺虾虎鱼研究中获得的结果相似。

致谢：感谢顾翠平，许则滩，严安琪，Jamel Tyso James，王一凡，谢斐昂实验室成员在采样、以及实验和数据分析过程中提供帮助。