绿侧花海葵寡肽对CCl4引起的小鼠急性肝损伤模型的影响

王予菲，唐云平，李小娟，刘成娟，陈亚南，杲亚许，杨最素，丁国芳,2

（1.浙江海洋大学食品与医药学院，浙江省海洋生物医用制品工程技术研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋水产研究所，浙江舟山 316021）

海葵属于腔肠动物门Coelen-terata、珊瑚虫纲Anthoroa、六放珊瑚亚纲Hexacorallia，有6科、37种，目前已报道的超过1 000种。现代药理学方法研究表明，海葵具有广泛的生物学活性[1]，其中已鉴定出约250种化合物（肽、蛋白质、酶和蛋白酶抑制剂）和非蛋白质物质（嘌呤、季铵化合物、生物胺和甜菜碱），包括抗菌[2]、抗癌[3]、抗心血管疾病[4]等多种药理活性。海葵毒素包括Na+和K+通道毒素、酸性离子通道毒素、细胞溶解素、Kunitz型蛋白酶抑制剂和抑制磷脂酶A2活性的毒素[5]。经过药理活性研究，这些海葵毒素多具有较强的神经和心脏作用，具有强心的药理作用。进一步研究表明，K+通道毒素APETx4与癌症相关[6]，并发现海葵毒素K+阻滞剂类似物ShK治疗自身免疫性疾病的作用[7]。

近几年，对于海葵提取活性肽类的研究也有较大进展。如张亚茹等[8]从舟山黄海葵提取了具有抗肺癌活性的物质。LOGASHINA,et al[9]发现具有镇痛作用的海葵肽。绿侧花海葵Anthopleura anjunae广泛分布于我国东海部分海域，每平方米绿侧花海葵的数量可达数百个。由于其生命力强，生长迅速，常对水产养殖造成一定的危害。到目前为止，开发利用绿侧花海葵活性肽的研究并不多。吴宗泽等[10]已对绿侧花海葵的酶解工艺做详细研究，并证明由5个氨基酸组成的寡肽Tyr-Val-Pro-Gly-Pro（AAP-H）具有较好的抗氧化活性和抑制前列腺癌细胞DU-145活性。LI Xiaojuan,et al[11]研究发现AAP-H可通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制前列腺癌细胞DU-145的增殖活性。鉴于其具有较好的抗氧化活性，本研究拟考察AAP-H对急性肝损伤的保护作用。

肝脏是身体内以代谢功能为主的一个器官，并在身体里面起着去氧化、储存肝糖、分泌性蛋白质的合成等作用。目前对于肝细胞的损伤模型主要包括免疫性、药物性、化学性等模型，对于化学性肝损伤研究的动物模型主要包括采用D-半乳糖胺盐酸盐、四氯化碳（CCl4）、硫代乙酰胺等[12]。有研究从文蛤、长鳍金枪鱼等海洋生物中提取多肽，研究其对化学性肝细胞损伤的修复作用[13-14]。CCl4已成为经典的复制肝损伤动物模型的化学物质[15]，广泛应用于动物肝损伤模型当中。

本实验对AAP-H进行了小鼠体内实验，给药造模后检测小鼠血清转氨酶和肝组织匀浆生化指标的变化，并观察小鼠肝组织的病理学的变化，从而证明APP-H对小鼠肝损伤具有保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

动物用SPF级雄性ICR小鼠48只，体重20±2 g，购于浙江省医学科学院，动物生产许可证号：SCXK（浙）2014-0001。在恒温（21～23）℃、恒湿（45%～65%）、各 12 h明暗周期的饲养室，自由进食和饮水。

1.1.2 试剂

绿侧花海葵寡肽AAP-H由无锡迈默拓普生物科技有限公司合成（纯度＞98%）。四氯化碳（分析纯）购于国药集团化学试剂有限公司。实验时，用橄榄油配成体积分数为1%的四氯化碳油溶液。2.5%戊二醛、4%多聚甲醛，购于国药集团化学试剂有限公司。联苯双酯滴丸，购于浙江万邦药业公司。伊红染色液购于碧云天天生物技术研究所；谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、超氧化歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物（GSH-Px）、丙二醛（MDA）试剂盒、BCA蛋白含量试剂盒及苏木精染液购于南京建成生物工程公司。

1.1.3 仪器

752FC紫外分光光度计，上海光谱仪器有限公司；切片机RM2135、摊片机HI1210、烤片机H1220，Leiea（莱卡）公司；OLYMPUS倒置显微镜，日本OLYMPUS公司；CF16RXⅡ日立低温离心机，日本日立公司。HITACHI H-7650透射电镜，日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组、模型复制及给药

将实验小鼠随机分为6组，每组8只，分别记为对照组、模型组、AAP-H低剂量组（75 mL·kg-1BW）、AAP-H中剂量组（150 mL·kg-1BW）、AAP-H 高剂量组（300 mL·kg-1BW）、联苯双酯组（简称阳性组，给药剂量150 mL·kg-1BW）。在造模前预防灌胃给药，连续7 d（对照组及模型组给予等量纯水），第7天末次灌胃后2 h，将各组小鼠（除对照组外）腹腔注射1%CCl4花生油溶液3 mL·kg-1BW，造成小鼠急性肝损伤。造模后小鼠禁食不禁水，20 h后摘眼球取血，室温静置2 h后，4℃，4 000 r·min-1转速离心10 min，收集上层血清，置于4℃冰箱保存；剥离肝脏，生理盐水漂洗后切取部分肝脏组织用于HE染色和电镜观察，剩余部分于-80℃冰箱保存。

1.2.2 血清转氨酶活性测定

陈校长不假思索地说：“此次校庆能受到社会各界的广泛支持。许多领导、校友，兄弟学校的代表以及同学家长，纷纷表示校庆活动既隆重又简朴，师生节目呈现出本校良好的精神风貌和才华。这意味着学校为此次校庆所付出的努力得到了大家的认可，令人十分感动！”

血液离心后取上清液，按相关试剂盒说明测定AST和ALT的活性。

1.2.3 肝脏组织生化指标含量测定

取小鼠肝脏，生理盐水漂洗后称重，制成10%肝脏匀浆液，按相关试剂盒说明，测定GSH-Px和SOD的活性、测定MDA的含量。

1.2.4 肝组织病理学检查

取小鼠相对位置肝脏1 cm×1 cm左右，生理盐水漂洗后，立即放入4%多聚甲醛溶液中，固定24 h，经常规脱水和二甲苯透明后，石蜡包埋，制备5 μm切片，用于HE染色，并于光学显微镜下观察拍照。

1.2.5 肝组织微观结构变化

小鼠肝脏切成0.5 cm×0.5 cm左右的组织块放入2.5%戊二醛固定液，由浙江大学电镜中心协助进行透射电镜检查。

1.3 数据处理

采用SPSS19.0统计软件处理数据。数据均采用x±s表示，不同处理间的差异采用one-way ANOVA进行比较分析。

2 结果

2.1 体重变化的测定

表1 AAP-H对小鼠体重变化影响（x±s,n=8）Tab.1 Effect of AAP-H on body weight changes of mice

2.2 肝重指数的影响

各组小鼠肝重指数见表2。与正常组小鼠相比，模型组、AAP-H低、中、高剂量组、阳性组小鼠肝重指数均升高（P＜0.05）；与模型组小鼠相比，给予AAP-H组小鼠肝重指数呈剂量依赖性增加，AAP-H中剂量和高剂量组达到显著水平（P＜0.05）。

表2 AAP-H对小鼠肝指数变化影响（x±s,n=8）Tab.2 Effect of AAP-H on liver index of mice

2.3 血清转氨酶含量测定

与正常组比较，模型组血清中ALT、AST含量升高（P＜0.05），差异有显著性，造模成功；与模型组比较，联苯双酯可明显降低ALT、AST含量（P＜0.05），AAP-H低、中、高剂量组均能显著降低小鼠血清中ALT、AST含量，且呈明显的量效关系（P＜0.05），见表3。说明所给药物联苯双酯及AAP-H均对CCl4引起的小鼠急性肝损伤有一定保护作用。

表3 AAP-H对小鼠血清ALT、AST的影响（x±s,n=8）Tab.3 Effect of AAP-H on serum ALT and AST of mice

2.4 肝匀浆抗氧化指标测定

2.4.1 肝组织GSH-Px活力水平测定

与正常组比较，模型组GSH-Px的活性显著降低（P＜0.05），差异有显著性，造模成功；与模型组相比，联苯双酯可明显升高肝组织GSH-Px活性（P＜0.05），AAP-H低、中、高剂量组均能显著升高GSH-Px活性（P＜0.05），见图1。说明所给药物联苯双酯及AAP-H均对CCl4引起的小鼠急性肝损伤有一定保护作用。

2.4.2 肝组织SOD活力水平测定

与正常组比较，模型组SOD的活性显著降低（P＜0.05），差异有显著性，造模成功；与模型组相比，联苯双酯可明显升高肝组织SOD活性（P＜0.05），AAP-H中、高剂量组显著升高SOD活性（P＜0.05），见图2。说明所给药物联苯双酯及AAP-H均对CCl4引起的小鼠急性肝损伤有一定保护作用。

图1 AAP-H对小鼠肝匀浆GSH-Px活性的影响Fig.1 Effect of AAP-H on hepatic GSH-Px activity of mice

图2 AAP-H对小鼠肝匀浆SOD活性的影响Fig.2 Effect of AAP-H on hepatic SOD activity of mice

2.4.3 肝组织MDA含量测定

与正常组比较，模型组MDA含量显著升高（P＜0.05），差异有显著性，造模成功；与模型组相比，联苯双酯可降低MDA 含量（P＜0.05），AAP-H 低、中、高剂量组均能显著降低MDA含量（P＜0.05），见图3。说明所给药物联苯双酯及AAP-H均对CCl4引起的小鼠急性肝损伤有一定保护作用。

图3 AAP-H对小鼠肝匀浆MDA含量的影响Fig.3 Effect of AAP-H on hepatic MDA content of mice

2.5 肝组织病理学检查

正常组小鼠肝小叶结构正常，细胞排列紧密，结构清晰，肝索呈放射状。模型组细胞索排列紊乱，有大量坏死和空泡，细胞出现脂肪变性。与模型组相比，阳性药联苯双酯组小鼠肝脏细胞大部分结构清晰，但小部分细胞还存在轻度坏死损伤。不同浓度的AAP-H均能使肝细胞的损伤减轻，其中AAP-H低剂量组肝组织可见结构紊乱和空泡，AAP-H高剂量形态最趋近于正常组，见图4。表明从病理角度观察，AAP-H及联苯双酯对CCl4引起的小鼠急性肝损伤均有不同程度的修复作用。

2.6 肝组织微观结构变化

正常组肝细胞结构完整、清晰，含有量丰富的线粒体、粗面内质网，胞浆中未见明显脂滴。模型组细胞内存在大量脂滴，部分肝组织结构破坏，为早期凋亡样改变，粗面内质网和线粒体数量减少。低剂量组细胞器形态有所改善，胞质内可见脂滴，线粒体肿胀。中剂量组肝细胞胞质内可见脂滴，细胞器形态相比低剂量组有很大改观。高剂量组细胞内脂滴分布明显改善，细胞器排列整齐，含有丰富线粒体。阳性组细胞胞浆中脂滴较少，线粒体数量丰富，存在轻度肿胀，可见大量滑面内质网而粗面，见图5。表明从微观结构上观察，AAP-H及联苯双酯对CCl4引起的小鼠急性肝损伤均有不同程度的修复作用。

图4 AAP-H对小鼠肝组织病理学变化影响（×400）Fig.4 Effect of AAP-H on mice hepatic pathological changes（×400）

图5 AAP-H对小鼠肝组织微观结构变化影响（×6 000）Fig.5 Effect of AAP-H on ultrastructure of hepatic pathological changes in mice（×6 000）

3 讨论

四氯化碳是经典的化学性肝损伤动物模型毒剂，在整体或离体被广泛用于肝坏死及肝损伤的研究，能够准确反映肝细胞的功能、代谢及形态学变化[16]。其肝损伤的机制与CCl4经细胞色素P450代谢产生的三氯甲烷自由基引发的链式过氧化反应有关，从而发生过氧化反应的过程，并产生的自由基导致肝损伤[17]。刘晨晨等[18]探究了鳕鱼皮胶原蛋白肽（cod skin collagen peptide,CSCP）对四氯化碳诱导的小鼠慢性肝损伤模型保护作用及相关应激信号通路和凋亡信号通路的调控机制。MA Xin et al[19]通过研究活化Aldehyde dehydrogenase 2作用于四氯化碳诱导的小鼠肝损伤，探究自由基的变化及肝损伤影响。血清中ALT、AST反应肝损伤情况，活性的高低在一定程度上可以反应肝细胞损伤程度。谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化歧化酶（SOD）反映着体内抗氧化水平，当自由基攻击肝细胞膜上的磷脂分子时，机体抗氧化系统瓦解，抗氧化酶活性降低[20]。丙二醛（MDA）间接反映基体细胞受到自由基攻击的严重程度。

从血清学指标以及肝匀浆的抗氧化指标检测结果来看，模型组ALT、AST明显升高，肝脏组织匀浆中，模型组SOD、GSH-Px降低，MDA升高，提示模型组肝细胞具有明显损伤，用CCl4造成小鼠肝损伤的动物实验模型成功。应用不同剂量绿侧花海葵寡肽影响四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤作用后，与模型组小鼠比较，血清中ALT、AST均有不同程度的降低，肝细胞匀浆中SOD、GSH-Px呈升高趋势，MDA有所降低，并呈剂量依赖性。联苯双酯组相比于模型组亦呈现相同的变化趋势。提示APP-H与联苯双酯均能一定程度上修复四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤作用。

从组织形态上看，AAP-H能明显减轻小鼠肝组织CCl4损伤后的脂肪变性、空泡、坏死等病理学变化，且微观结构中可见，相比于模型组，AAP-H作用后肝细胞脂滴减少，粗面内质网明显增加，线粒体数量增加，空泡及坏死结构得到修复，进一步证明APP-H对急性肝损伤有一定保护作用。应用联苯双酯作用组，肝索结构较为清晰，有部分空泡；微观结构中可见，细胞滑面内质网增多，使得肝细胞胞质内脂滴明显减少，一定程度上修复了CCl4引导的急性肝损伤作用。这可能与联苯双酯作用机制调控P450同工酶，从而促进肝细胞滑面内质网增生，使细胞色素P450显著增加，从而加快药物的代谢，减轻药物对肝脏的损伤相关，而滑面内质网可增加脂质代谢的参与，减少脂滴的形成[21]。

总之，AAP-H对CCl4引导的急性肝损伤具有一定的修复作用，但其修复CCl4引导的急性肝损伤的分子机制还需进行进一步的研究，从而为其作为修复急性肝损伤的功能性肽类产品或药物佐剂奠定基础。