猪化脓隐秘杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立

田佳琪，姚亚辉，赵化丹，李 敏，朱茗莉，马红霞，高云航*

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118；2.辽源市东丰县东丰广播电视台，吉林辽源136300)

化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes)属隐秘杆菌属，作为一种条件致病菌可以在猪、鹿、羊、牛等多种哺乳动物中广泛传播，造成重大损失。现今，对T.pyogenes的临床检测手段仅为PCR 检测。酶联免疫吸附试验(ELISA)是临床检测抗体的可靠手段，其主要原理是将抗原包被液结合固相载体表面，利用抗原与抗体之间的特异性结合对免疫反应定性和定量检测[1]。超声裂解的全菌蛋白作为包被抗原具有良好的可操作性，Miranda 等以超声裂解后的羊泰勒虫为包被抗原建立的间接ELISA 方法检测羊血液抗体[2]；马福利等以超声裂解副猪嗜血杆菌为包被抗原建立的间接ELISA 检测方法[3]；曹俊、李娇阳、李富祥等均以超声裂解的方式处理抗原，并作为包被液建立间接ELISA 检测方法，结果显示经过超声裂解的包被液具有较好的稳定性[4-6]。综上所述，超声裂解抗原作为间接ELISA(iELISA)的抗原包被液具有操作方法便捷、测试结果较稳定等优点。本研究通过超声破碎猪源T.pyogenesTP-2849菌株获得包被抗原，建立T.pyogenesiELISA 检测方法，对T.pyogenes抗体的检测和血清流行病学调查具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 TP-2849 株猪T.pyogenes由本实验分离鉴定并保存。T.pyogenes、副猪嗜血杆(HPs)、猪大肠杆菌(E.coil)、猪巴氏杆菌(PM)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)阳性血清均由本实验室制备保存。以上8 种病原阴性血清均购自中国农业科学院兰州兽医研究所。100 份待检猪血清样品采集自吉林省某疑似发病养殖场。

Tween-20、BSA 购自 Solarbio 公司；兔抗猪IgG-HRP 购自 SouthernBiotech 公司；MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、RNA to cDNA EcoDryTMPremix (Oligo dT)试剂盒均购自TaKaRa 公司。

1.2T.pyogenes全菌蛋白包被液的制备 取800 mL OD600nm≈0.8 的 TP-2849 菌液，以 4 000 r/min 离心10 min，弃上清。以pH7.4 的PBS 洗菌体，重复3次，以1∶50 加入pH9.6 碳酸盐缓冲液制成浓缩悬液，经超声破碎30 min 后8 000 r/min 离心6 min，以0.22 μm 滤膜过滤，并以核酸蛋白仪检测抗原质量浓度后冻存于-20 ℃冰箱，作为抗原包被液备用。

1.3 iELISA 最佳反应条件的确定 本研究通过方阵法[3]对抗原最佳包被浓度(1∶200、1∶400、1∶600、1∶800、1∶1 000)、封闭液及其浓度(0.5 % BSA、1 %BSA、1.5 % BSA)、反应时间(1 h、1.5 h、2 h)、反应温度(4 ℃、室温25 ℃、37 ℃)、血清最佳稀释度(1 ∶100、 1 ∶200、 1 ∶300、 1 ∶400、 1 ∶500)、 兔 抗 猪IgG-HRP 最佳稀释度(1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000)、进行优化。实验结果中阳性对照OD450nm趋近于1；阴性对照OD450nm趋近于 0.1，且P/N 平均值最大孔为最佳反应条件。

1.4 临界值的确定 按照参考文献[6]方法确定临界值，以最佳反应条件对50 份经PCR 方法检测无T.pyogenes感染的健康猪血清进行检测，并设置阴性、阳性对照。计算S/P 值以及(S/P 平均值)与标准差SD，当待检样品S/P≥+2SD 判定为阳性，S/P≤+2SD 判定为阳性。

1.5 特异性试验 利用建立的iELISA 方法检测T.pyogenes、 HPs、E.coil、 PM、 CSFV、 PRRSV、PPV、PRV 阳性血清，每个样品3 次重复，评估该方法的特异性。

1.6 敏感性试验 将1 份T.pyogenes阳性血清样品2 倍倍比稀释(1∶1～1∶512)后分别作为包被抗原，利用建立的iELISA 方法检测，确定该方法的敏感性，并与参考文献[7]的结果比较分析。

1.7 重复性试验 按照参考文献[3]进行重复性试验，以本研究建立的iELISA 对5 份阴性、5 份弱阳性、5 份阳性、5 份强阳性猪血清进行批内重复性试验，每份样品3 个重复。将上述血清样品在不同时间重复3 次，检测该方法的批间重复性，计算批内、批间变异系数，以判断该方法的稳定性。

1.8 临床样品检测 利用本研究建立的iELISA 检测100 份猪血清样品。同时按照RNA 提取试剂盒提取100 份样品中的RNA，经反转录成cDNA，利用PCR 方法扩增T.pyogenes的 16S rRNA 保守区序列(TY1：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/TY2：GGTTA CCTTGTTACGACTT)，计算两种方法的符合率。其中，阳性符合率= 两种方法阳性结果相同数/PCR方法阳性样品数；阴性符合率= 两种方法阴性结果相同数/PCR 方法检测阴性样品数；总符合率=(阳性结果相同数+阴性结果相同数)/总样品数。

2 结 果

2.1 iELIS A 最佳反应条件和临界值的确定 经方阵法进行条件优化，该iELISA 方法最佳反应条件为：抗原(10 ng/μL)经 1∶600 倍稀释后 4 ℃包被过夜；1%BSA 37 ℃封闭 1 h；血清 1∶400 倍稀释 37 ℃孵育 1 h；兔抗猪 IgG-HRP 1∶2 000 倍稀释 37 ℃孵育1 h；TMB 室温孵育15 min。

利用该iELISA 对50 份健康猪血清进行检测，其 S/P 的平均值为 0.185，SD 为 0.054，阳性临界值2SD 为 0.293，即 S/N＞0.293 结果为阳性；S/P＜0.293 结果为阴性(图1)。

图1 阴性样品结果正态分布图Fig.1 Negative samples normal distribution diagram

2.2 特异性试验结果 利用建立的iELISA 检测T.pyogenes、 HPs、E.coil、 PM、 CSFV、 PRRSV、PPV、PRV 阳性血清，结果显示仅T.pyogenes血清呈阳性，其余均为阴性(图2)，表明该方法特异性较强。

图2 iELISA 特异性试验结果Fig.2 The specificity test of the iELISA

2.3 敏感性试验结果 利用建立的iELISA 对二倍倍比稀释后的阳性血清进行检验，结果显示可检测出的阳性血清最大稀释度为1∶128 (图3)，经与参考文献[7]的方法检测结果比较，表明该方法敏感较高。

2.4 重复性试验结果 利用优化后的iELISA 对20份血清进行批内与批间重复性试验。经统计分析，批内变异系数小于9.5 %，批间变异系数小于9 %(表1)，表明本研究所建立的方法具有较好的可重复性。

2.5 临床样品检测 100 份猪血清样品分别以PCR方法与本研究建立的iELISA 检测，结果显示，PCR检测方法与iELISA 方法检测的阴、阳性血清与总符合数分别为14、80 和94。经计算二者的总符合率为94 %，表明本研究建立的iELISA 检测结果准确度较高与PCR 方法敏感性相近，可以用于对临床样品的检测。

图3 iELISA 敏感性试验Fig.3 The sensitivity test of the iELISA

表1 iELISA 重复性试验Table 1 The reproducibility test of the iELISA

3 讨 论

T.pyogenes是一种多形态、革兰氏阳性兼性厌氧菌，实验室环境培养T.pyogenes需要较高的营养条件。研究者对T.pyogenes进行流行病学调查发现，T.pyogenes可以在易感动物体内长时间存活[8]。近年来，对T.pyogenes的研究中发现其可以引起奶牛子宫内膜炎和乳房炎等，也可以引起猪关节炎与肺炎、肉牛肝脓肿和火鸡骨髓炎。研究表明，山羊睾丸感染T.pyogenes后会导致死精率增加与精子畸形，并可以诱发睾丸间质性水肿[9]。本实验室对近3年吉林地区感染T.pyogenes猪群进行流行病学调查结果显示，该病常由猪皮肤创口感染或呼吸道感染引发，猪在感染PRRSV 或 HPs 后可致T.pyogenes感染的几率极大，导致其病死率增高。

目前，对T.pyogenes的检测方法主要为PCR 方法扩增16S rRNA，将其扩增序列在BLAST 中进行匹配度比较，但PCR 方法检测的准确性与实验环境控制、操作人员的技术水平密切相关。iELISA 检测方法是一种以聚苯乙烯为固相载体使得抗原与抗体特异性结合，且操作方法简单快捷，并可以快速检测抗体效价。本研究以超声裂解猪源T.pyogenes分离株TP-2849 (NZ_CP029004)，以全菌蛋白作为包被抗原，经反应条件优化建立了T.pyogenes抗体iELISA 检测方法。经特异性试验结果表明该方法具有较强的特异性，与 HPs、E.coil、PM、CSFV、PRRSV、PPV、PRV 阳性血清均无交叉反应。为获取准确数据，本方法以S/P 值对iELISA 检测结果进行判定，该方法显著降低了人为误差与环境因素等对试验结果的影响[10]。重复性试验与敏感性试验结果表明，本方法具有较高的敏感性与较好的稳定性。临床样品检测结果显示本研究建立的iELISA 检测方法与PCR 扩增16S rRNA 方法的总符合率为94 %，两种方法的符合率较高，表明该方法可以用于临床样品的检测。综上所述，本研究建立的iELISA 方法可以用于T.pyogenes感染的流行病学调查，并可为该病原防控提供一种快速、准确的抗体检测手段。