基于高通量测序分析西藏北部高寒草甸不同深度土壤线虫群落分布特征

薛 蓓,侯 磊,薛会英

西藏农牧学院,林芝 860000

土壤线虫是土壤动物中的优势类群,被认为是地球上数量最大的多细胞生物[1-2]。土壤线虫有多种食性,其功能(营养)结构是土壤物质循环和能量流动的重要决定因素之一,同时也能够提供土壤腐屑食物网机能方面的信息,土壤线虫在草地生态系统中往往被看作是主要的消费者,与草地生产力密切相关[3-7]。

传统的形态学分离鉴定土壤线虫需要借助显微镜分辨,而且鉴定人员需要进行专业的培训,耗时耗力[8],例如从单个样品中分离鉴定100—150个土壤线虫需要专业研究人员花费1 h以上[9]。21世纪以来,新一代高通量测序技术的发展日新月异,可直接测序 16S rRNA 基因的 PCR产物,每次分析获得的基因序列数以百万甚至亿万计,不仅通量高,而且能够同时分析上百个不同的样品,是解析复杂环境中微生物群落物种组成和相对丰度的重要工具[10-11]。

目前,高通量技术在线虫研究中得到了一定的应用[12],如国外学者对热带雨林和北极地区的线虫多样性[13]、地中海灌木丛线虫多样性[14]的研究以土壤活线虫作为一种生物指标,研究分析外来植物在沿海沙丘生态系统中的侵袭作用[15]、热带和温带雨林的线虫空间和生态模式[16]和热带雨林生物多样性[17]等。国内如冯陈晨等对骆驼斯氏副柔线虫转录组进行高通量测序及分析[18]。

本文通过Illumina MiSeq测序技术,在 97%的相似水平下对所测得序列进行OUT聚类和生物信息学分析,研究藏北高寒草甸不同土壤深度线虫群落结构特征,目的是全面了解高寒草甸不同深度土壤线虫群落多样性,为进一步研究不同植被不同气候变化下土壤线虫群落特点提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验地概况

实验样地设置在西藏大学-中国科学院青藏高原研究所那曲生态环境综合观测研究站内(31°31′38″—31°32′02″N,92°04′03″—92°04′16″E),采样区域土壤为高山草甸土,其地被植物主要优势种及亚优势种有高山嵩草(Kobresiapygmaea)、矮火绒草(Leontopodiumnanum)、矮生嵩草(K.humilis)、二裂委陵菜(Potentillabifurca)、钉柱委陵菜(P.saundersiana)、乳白香青(Anaphallislactea)等[19]。

1.2 样品采集

2017年8月,在实验场地内设置 3个六边形样地(3个重复),样地面积均为2.5 m×2.5 m,每个六边形样地间距大于100 m。2017年8月,采用三点采样法,分别采集0—5、5—10、10—15、15—20、20—25 cm 5个深度的土层原状土样,装入无菌采样袋中,放入冰盒内,于12 h内带回实验室置于-80℃冰箱内保藏备用。将样品按照不同深度进行样品编号,0—5 cm的土壤样品编号为ZBCD1,5—10 cm的土壤样品编号为ZBCD2,10—15 cm的土壤样品编号为ZBCD3,15—20 cm的土壤样品编号为ZBCD4,20—25 cm的土壤样品编号为ZBCD5。各样品含水率等理化性质见表1。

ZBCD：藏北草地的汉语拼音首字母简写；同列数据小写字母不同表示土层间差异显著(P<0.05)

1.3 DNA 抽提和PCR扩增

根据E.Z.N.A.® soil试剂盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)说明书进行总DNA抽提,DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测,利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；参考文献[10],采用NF15′-GGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTT-3′和18Sr2bR 5′-TACAAAGGGCAGGGACGTAAT-3′引物,参考文献[20]进行PCR扩增。

1.4 Illumina Miseq测序

委托上海美吉生物医药科技有限公司利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序。

1.5 数据处理及分析

在上海美吉生物医药科技有限公司云平台上进行在线分析(www.i-sanger.com)。其他数据处理采用SPSS20软件。测序数据比对数据库为NCBI(NT)。

2 结果与分析

2.1 测序数据统计及OTU组成分析

测序数据统计如表2,从表2可以看出通过对藏北草甸土壤不同深度各样品中线虫基因测序,5个样品总计测得原始序列条数为(182612±4463)条,质控序列总数为(182164±977)条,共产生990个OTU。其中ZBCD2(5—10 cm)样品中的OTU最多,达到了214个OTU,ZBCD3(10—15 cm)样品中的OTU最少,仅为157个。

表2 样品间测序数据统计Table 2 Sequence data statistics of samples in different fermentation processes

同列数据小写字母不同表示土层间差异显著(P<0.05)

以多样性指数为sobs(表征实际观测到的物种数目)做稀释曲线如图1。从图1可知,5个样品的稀释曲线均基本趋于平缓,说明所得序列可基本反映真实环境中土壤线虫群落结构。

图1 不同区组土壤线虫测序的稀释曲线Fig.1 Rarefaction curves of soil nematodes communities in different soil compartmentsZBCD：藏北草地的汉语拼音首字母简写

图2 不同区组土壤线虫群落 OTU韦恩图Fig.2 OTU Venn diagram of soil nematodes communities in different soil compartments

不同区组土壤线虫群落OTU韦恩图如图2,共同含有的OTU统计结果见表2。从图2可知,5个样本中共同含135个OTU,其中ZBCD1(0—5 cm)独有23个OTU,ZBCD2(5—10 cm)独有21个OTU,ZBCD3(10—15 cm)独有11个OTU,ZBCD4(15—20 cm)独有25个OTU,ZBCD5(20—25 cm)独有28个OTU,分别占总各自OTU总数的14.56%、13.46%、7.53%、15.63%和17.18%。

2.2 样品间Alpha多样性分析

各样品中的Alpha多样性指标如表3。由表3可以看出,不同深度线虫群落样品间Alpha多样性统计中的Chao1指数、Ace 指数差异显著(P<0.05)；Shannon指数在ZBCD1和ZBCD5间差异不显著(P>0.05),而这两组样本和其他三组之间Shannon指数差异显著(P<0.05)。Shannon值最高的ZBCD2(5—10 cm)样品除了具有较高的群落多样性以外,其Chao1指数和Ace指数分别为285.27±17.71和294.47±30.96,具有较高的群落丰富度。

2.3 纲水平各样本土壤线虫群落分布图

纲水平各样本土壤线虫群落分布图如图3。从图3可知,在ZBCD1、ZBCD2、ZBCD3、ZBCD4、ZBCD5中刺嘴纲(Enoplea)是优势土壤线虫群落,分别占到各样本线虫群落的72.13%、80.51%、76.79%、54.72%和77.90%；其次为色矛纲(Chromadorea),在ZBCD1、ZBCD2、ZBCD3、ZBCD4、ZBCD5中分别占到各样本线虫群落的17.54%、12.04%、12.62%、28.13%和16.92%,位于第3位的是在未分类的线虫纲(unclassified_p_Nematoda),在ZBCD4中相对含量最高,为17.15%。

2.4 目水平上不同区组土壤线虫相对丰度

目水平各样本土壤线虫群落分布图如图4。从图4可知,在5个样本中属于土壤线虫的群落目分别是矛线目(Dorylaimida)、垫刃目(Tylenchida)、未分类的线虫目(unclassified_p_Nematoda)、三矛目(Triplonchida)、小杆目(Rhabdtida)、刺嘴目(Enoplida)和疏毛目(Araeolaimida)这7个目。其中矛线目(Dorylaimida)在5个样本中含量均较高,其在ZBCD2中的相对丰度最高,含量为79.49%,其在ZBCD4中的相对丰度最低,含量为48.13%；刺嘴目(Enoplida)在ZBCD4中的相对丰度较高,含量分别为22.72%；三矛目(Triplonchida)在ZBCD4和ZBCD5中相对丰度较高,含量分别为6.59%和7.83%。

表3 样品间Alpha多样性统计Table 3 Alpha diversity in different sample

ZBCD：藏北草地的汉语拼音首字母简写；同列数据小写字母不同表示土层间差异显著(P<0.05)

图3 纲水平上不同区组土壤线虫分布图Fig.3 Frequence of Class level in soil nematode communities from samples

图4 目水平上不同区组土壤线虫差异检验柱形图Fig.4 Frequence of Order level in soil nematode communities from samples

2.5 聚类分析

属水平的各样本土壤线虫群落TOP50热图分析见图5。从图5样品间属水平的聚类关系可知,ZBCD2和ZBCD3群落组成是最相似的,ZBCD5、ZBCD4、ZBCD1、ZBCD2和ZBCD3群落的组成相似性有一个递增的趋势。热图中共显示30 个土壤线虫属,分别为Melenchus(剑尾垫刃属)、Meloidoderita(无对应中文)、Ecphyadophora(突腔唇属)、Prismatolaimus(棱咽属)、Tylenchus(垫刃属)、Clavicaudoides(无对应中文)、Tylencholaimus(垫咽属)、unclassified_p_Nematoda(未分类的线虫属)、Acrobeloides(拟丽突属)、Paravulvus(无对应中文)、Aphelenchus(滑刃属)、Odontolaimus(齿咽属)、Hoplolaimus(纽带属)、Paratrichodorus(拟毛刺属)、Filenchus(丝尾垫刃属)、Alaimus(无咽属)、Aphelenchoides(类滑刃属)、Merlinius(默林属)、Dorylaimellus(牙咽属)、Meloidogyna(根结线虫属)、Pratylenchus(短体属)、Longidorus(长针属)、Acrobeles(丽突属)、Aglenchus(野外垫刃属)、Cylindrolaimus(筒咽属)、Ditylenchus(茎属)、Belonolaimus(刺属)、Proleptonchus(原细齿属)、Ecumenicus(通俗属)、Rhabdolaimus(杆咽属)。Tylencholaimus(垫咽属)在5 个样本中相对含量较高,ZBCD5共检测到30 个属,ZBCD1、ZBCD2、ZBCD3和ZBCD4分别共检测到23、24、19、22个属。

图5 不同样品间的土壤线虫heatmap图Fig.5 Heatmap of the soil nematodes in different samples Melenchus：剑尾垫刃属、Meloidoderita：无对应中文、Ecphyadophora：突腔唇属、Prismatolaimus：棱咽属、Tylenchus：垫刃属、Clavicaudoides：无对应中文、Tylencholaimus：垫咽属、unclassified_p_Nematoda：未分类的线虫属、Acrobeloides：拟丽突属、Paravulvus：无对应中文、Aphelenchus：滑刃属、Odontolaimus：齿咽属、Hoplolaimus：纽带属、Paratrichodorus：拟毛刺属、Filenchus：丝尾垫刃属、Alaimus：无咽属、Aphelenchoides：类滑刃属、Merlinius：默林属、Dorylaimellus：牙咽属、Meloidogyna：根结线虫属、Pratylenchus：短体属、Longidorus：长针属、Acrobeles：丽突属、Aglenchus：野外垫刃属、Cylindrolaimus：筒咽属、Ditylenchus：茎属、Belonolaimus：刺属、Proleptonchus：原细齿属、Ecumenicus：通俗属、Rhabdolaimus：杆咽属

2.6 线虫群落与土壤化学指标的关系

图6为不同深度藏北草甸土壤门水平微生物群落与土壤化学指标(表1)关系,第一主轴和第二主轴对土壤线虫群落相对丰度方差的解释比例分别为38.64%和17.18%,两者共解释55.82%的方差变化。第一主轴上,K(K+)和HSL(含水率)是主要的影响因子,相关系数分别-0.81和-0.97,差异显著(P<0.05)。第二主轴上,YJZ(有机质)和Zn(Zn2+)是主要的影响因子,相关系数分别为-0.92和-0.91,差异不显著(P>0.05)。综上,与不同深度藏北草甸土土壤门水平微生物群落相关性较大的土壤化学指标是K+、含水率、有机质和Zn2+。K+与线虫门(Nematoda)有较强正相关性,与子囊菌门(Ascomycota)、环节动物门(Annelida)、拟杆菌门(Phragmoplastophyta)和担子菌门(Basidiomycota)负相关；含水率与线虫门(Nematoda)、拟杆菌门(Phragmoplastophyta)和担子菌门(Basidiomycota)正相关,与子囊菌门(Ascomycota)和环节动物门(Annelida)负相关；有机质与线虫门(Nematoda)、拟杆菌门(Phragmoplastophyta)和担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)正相关,与环节动物门(Annelida)负相关；Zn2+与拟杆菌门(Phragmoplastophyta)和担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)正相关,与环节动物门(Annelida)无相关性,与线虫门(Nematoda)负相关。

图6 门分类水平土壤线虫群落与土壤化学指标的冗余分析Fig.6 Redundancy analysis of soil nematode phyla and chemical parameters

3 讨论与结论

研究区域地处青藏高原冻土带,其草地植被的植物区系、形态、生理生化都具有典型的高原特点。冻土能敏感地反映气候变化,季节性冻土则因周期性的冻融交替,显著地影响着土壤生物的种群和群落特征[21]。本研究通过Illumina MiSeq测序技术鉴定到的藏北高寒草甸(盛长期)(高山嵩草群落)土壤线虫类群属数高于通过传统鉴定手段得(藏北高山嵩草群落)到2纲6目[21],运用该技术研究藏北高山嵩草线虫群落还未见文献报道。

(1)高通量测序结果表明藏北高山嵩草(盛长期)5个土壤样品中的(990±58)个OTU分属于1个门,3个纲,7个目,25个科,30个属。刺嘴纲(Enoplea)、色矛纲(Chromadorea)是藏北高山嵩草平均相对丰度最高的纲,其中刺嘴纲(Enoplea)在ZBCD2(5—10 cm)中相对含量最高,达到80.51%,色矛纲(Chromadorea)在ZBCD4(15—20 cm)中对含量最高,达到28.13%。从0—25 cm的5份土壤样本中共同含有135个OTU,其中ZBCD5(20—25 cm)独有28个,高于5—20 cm4个样本中独有的OUT数。

(2)不同深度藏北高山嵩草(盛长期)线虫群落结构相关性较大的土壤化学指标是K+、含水率、有机质和Zn2+。其中K+、含水率、有机质与线虫门(Nematoda)有较强正相关性,而Zn2+与线虫门(Nematoda)的呈现较强负相关性。而线虫中食细菌性线虫和食真菌性线虫所占比例较大,通过分析与土壤中拟杆菌门(Phragmoplastophyta)和担子菌门(Basidiomycota)呈现一定的负相关。

藏北地区地处青藏高原腹地,气候干寒,是全球气候变化的敏感地带,是藏北地区面积最大、最重要的生态系统,其间广泛分布的高寒草甸类草地具有典型的区域代表性,其中高山嵩草群落作为最具代表的植被类型,其区系、形态、生理生化能较好的反映气候环境变化[3-7]。本研究通过当下热门的微生物生态学研究技术—高通量测序技术(High-throughput sequencing)研究土壤线虫。传统的土壤线虫研究方法是基于线虫的直接分离鉴定来分析环境中的线虫的群落结构及其生态关系的,但传统的形态学分离鉴定土壤线虫需要借助显微镜分辨,而且鉴定人员需要进行专业的培训,耗时耗力,传统的分离鉴定手段一直难以让人们全面了解环境中线虫的群落结构及生态关系。21世纪以来,DNA测序技术取得革命性突破,新一代高通量测序16S rRNA基因极有可能成为一种常规手段分析土壤微生物的物种多样性变化规律,成为土壤质量评价的常规方法。高通量测序法具有分析样本量多、单个样品序列通量高的优点,高通量测序能够较为全面和准确的反映土壤微生物群落结构[10,22]。

本文是以本课题组在藏北高寒草甸开展了数年的土壤线虫群落研究为基础,采用NF15′-GGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTT-3′和18Sr2bR 5′-TACAAAGGGCAGGGACGTAAT-3′引物通过Illumina MiSeq测序技术,在97%的相似水平下对所测得序列进行OUT聚类和生物信息学,以获得土壤线虫群落在不同深度的分布情况,并试图将所获得的结果与环境条件(水分含量、化学性质等)进行相关性分析,发现不同深度土壤线虫种类及丰度存在一定的差异,为下一步研究不同植被以及不同气候条件下的土壤线虫群落结构和多样性特征提供方法上的有力支持。