水稻稻瘟病检测实验分析

吴利森

摘 要：本文以不同浓度稻瘟菌粗毒素处理神农265和294水稻幼苗。测量幼苗的致病性，并检测和实验分析防御酶系统、可溶性蛋白质和同工酶标记物。结果表明，12天培养基中提取的粗毒素对培养液的毒性最强，水稻种子萌发，种子萌发和种子萌发均有明显的抑制作用。不同浓度的毒素对水稻幼苗的POD，SOD和可溶性蛋白有一定的诱导作用;同工酶检测显示粗毒素代替粗毒素，幼苗的POD酶有明显的变化。

关键词：水稻;稻瘟病;检测;实验分析

稻瘟病又称稻瘟病和叩头瘟，是一种由病原真菌引起的水稻病害，严重影响水稻的产量和品质。稻瘟病引起的水稻年产量损失在世界范围内为11%至30%。目前，化学防治仍然是控制稻瘟病的必要手段。但化学农药的长期使用容易造成环境污染和耐药性。近年来，生物防治已成为防治植物病害的重要途径。拮抗微生物不仅具有抑制植物病害的能力，而且对人和动物无害，污染环境。因此，生物防治被认为是预防植物病害的最有前途的方法之一。本实验筛选出对稻瘟病具有良好抑制作用的拮抗菌，研究了拮抗菌对稻瘟病的防效，并对其进行鉴定。目的是挖掘多功能高效的稻瘟病菌株，为稻瘟病的生物防治奠定基础。

一、材料与方法

1.试验材料

选择了不同抗性的神农265和294的水稻品种的种子。测试稻瘟病的病原体由ZB1、ZD1、ZD5、ZE1、ZF1等其他生理小种混合组成。

2.水稻稻瘟病菌的制备

在斜面上将稻瘟病菌与PDA（马铃薯20%，琼脂17.5g / L，蔗糖30g / L）连接，并且灰色菌丝体在26度下生长约2周。 将上述活化的稻瘟病菌接种于培养基（KH2PO4、K2HPO4、MgSO4各0.5g / L，酵母提取物粉末5g / L，葡萄糖20g / L）中，在避光振荡（150 r / min）的25度光避光培养。用无菌纱布过滤病原体的培养基并10000 r / min离心10分钟，然后将上清液在高压下灭菌20分钟。

3.水稻稻瘟病菌的检测

将100个测试品种的种子置于含有水，1/4毒素稀释剂，1/2毒素稀释剂和毒素原液的4种处理液放置于培养皿中，每天1次换液，并且30℃浸泡3天后计算发芽数和非发芽种子数，计算粗毒素对种子萌发的抑制率;另选取测试材料用清水浸泡培养发芽后，将水，1/4毒素稀释液，1/2毒素稀释液和毒素原液放入4种处理业的培养皿中。10天后，测量胚根的胚芽长度并计算生长抑制率。

4.水稻幼苗生理生化指标的检测

样品处理 将水稻种子在轻质培养箱中消毒后，将种子在轻度培养箱中培养。2周后，将水滴入，将水，1/4毒素稀释剂，1/2毒素稀释剂和毒素原液加入不同品种的培养皿中，并分别在0、12、24、36、48小时取样。

酶的提取 将0.1 g幼苗叶加入到1mL预冷的磷酸盐缓冲溶液中以研磨成匀浆，转移到1.5 mL的EP管中，以1000 r / min离心20分钟，上清液为酶的粗提物，于4℃下保存

过氧化物酶（POD）酶活性测定 根据Wu等方法，以愈创木酚为底物，测定470 nm处的OD值。即1 g/ min蛋白质的在470 nm处OD值（酶活性）。

超氧化物歧化酶（SOD）酶活性测定 按Wu等方法。不添加酶溶液的光照射测定的OD值为100%。一个酶活性单位（U）为抑制50%NBT光还原的酶活性，并计算酶的比活性。

可溶性蛋白（SP）测定 通过参照Bradfod的G-250法来测定，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准曲线来测定。

二、结果与分析

1.粗毒素的毒性测定

（1）粗毒素对水稻种子萌发的抑制率

比较毒素在不同培养时间的毒性。在培养基的第3天培养中，细菌逐渐生长并逐渐生长。12天后，培养基的颜色逐渐变暗。当培养至24日龄时，桡骨菌丝脱落成平滑的细菌球，并且培养基几乎为黑色。在此期间测量了毒素的毒性。

试验材料在12天不同浓度下对种子萌发的抑制作用（图1），粗毒素浓度不同，对种子萌发的抑制作用不同，且不同品种的抑制率不同。随着粗毒素浓度的增加，种子萌发次数相对减少，表明粗毒素对水稻种子萌发有一定的抑制作用，种子萌发抑制率与毒素浓度呈正相关，抑制率随着毒素浓度的增加而增加。

（2）粗毒素对水稻胚根和胚芽的抑制率

不同浓度的试样材料对根和芽生长的抑制结果表明，毒素处理的胚根和胚芽的根和胚芽长度显得低于对照，表明粗毒素具有一定的抑制作用对根芽生长有一定的影响，随着毒素浓度的增加，胚根对细菌的毒性增强。根据毒素对两个品种的抑制率，绘制粗毒素的毒性曲线（图2）。从图中可以看出，神农294品种的毒素母液在粗毒素的培养基中于25℃，150 r / min培养，并且在12天时毒性最强。因此，神农294品种的毒素母液的粗毒素适合在12天培养。另外，从2个品种的发芽率以及胚根和胚芽的抑制率来看，神农265的抗性比神农294的高。

2.過氧化物酶活性的测定

用粗毒素处理后水稻幼苗中POD酶的活性的比较中。由于各浓度的POD酶活性不同，但总的来说，POD酶活性随时间增加而增加。不同浓度毒素处理后，神农265和294的POD活性均高于对照。神农265在酶活性高峰出现在36 h，其中50%，毒素处理下的酶活性比对照高2倍。36小时后，下降接近于控制;神农294出现在12h达到峰值，然后下降，但一般高于对照水平，50%和毒素浓度下品种的峰值较高。总体而言，神农294酶活性峰值低于神农265。

3.超氧化物歧化酶活性的测定

经过粗毒素处理后，SOD酶的活性开始增加，然后在一段时间后下降。在神农265中，酶活性在24 h达到最大值，酶活性下降低于对照水平，神农294在12 h酶活性达到最大值，酶活性下降36-48 h，接近到控制。2个品种的最大酶活性为50%浓度以下的水稻幼苗活性高峰，说明SOD酶活性对浓度敏感，而不同浓度粗毒素的SOD活性变化不明显。

4.可溶性蛋白的测定

神农265和294在12-48 h之间处理时间下，可溶性蛋白含量会呈下降趋势，不同浓度粗毒素处理的可溶性蛋白含量均低于在36 h时下降到最低值，而25%浓度的整体趋势变化最明显。

5.过氧化物同工酶的分析

对其进行POD同工酶分析，我们用相同浓度的毒素处理的幼苗的POD发现其具有明显的差异，并且酶带的颜色深度变化很大。并且同一品种的颜色随着粗毒素浓度的增加而变浅，可以得到稻瘟病菌粗毒素对过氧化物酶有明显的抑制作用，并且随着浓度的增加而增强。

三、结果与讨论

本实验产生的粗毒素对水稻种子的萌发，胚芽和胚根的生长均表现出很强的抑制作用，说明粗毒素具有一定的致病性，可作为选择压力筛选突变体。目前，使用致病毒素筛选水稻稻瘟病突变体的报道很多。用不同浓度的粗毒素处理2种水稻幼苗后，无论是从生长潜力还是从抑制率来看，神农265都比神农294表现出更高的抗性。

不同浓度的毒素对水稻幼苗防御酶具有一定的诱导能力，可溶性蛋白含量变化显着。这表明毒素治疗的早期阶段受到超氧自由基的攻击并激活SOD防御酶。神农294的活性峰值高于神农265，表明神农294对毒素较敏感，细胞膜早期受损。可溶性蛋白质的减少表明毒素抑制植物生长并抑制某些蛋白质的合成。POD是细胞内的活性氧清除剂，因此在毒素应激下酶活性增加。对过氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性测定知POD酶的活性比SOD更明显，表明POD对稻瘟病毒粗毒素更为敏感。目前研究表明，过氧化物酶和稻瘟病与稻瘟病密切相关。当稻子被稻瘟病感染时，体内的过氧化物酶将发生显著变化。通过比较2个品种的相应同工酶谱，可以看出，神农265的POD酶活性明显高于神农294，说明毒素对酶活性的抑制作用较弱，即神农265对稻瘟病菌粗毒素的抗性强于神农294，与苗期抗病性鉴定结果一致，从而了解过氧化物酶和水稻的活性。

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