复合菌发酵米粉的制作工艺优化及其香气成分

席慧婷,江平屿,陈星光,徐军军,黄赣辉,邓丹雯,*

(1.南昌大学,食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.江西汪氏蜜蜂园有限公司,江西南昌 330100)

米粉是我国南方地区十分流行的小吃,是江西人民最爱的食物之一[1]。发酵米粉质地柔韧、富有弹性、水煮不糊汤、干炒不易断,配以各种小菜进行炒制或用汤料进行汤煮,细腻柔滑,深受广大消费者的喜爱。

米粉分为发酵米粉和非发酵米粉,经发酵的米粉较非发酵米粉口感爽滑、劲道感十足[2],从而提高了米粉的食用品质。经植物乳杆菌发酵的米粉具有较小的蒸煮损失率和较大的复水率[3]。目前,针对乳酸菌和酵母菌复合发酵米粉的研究较少。阳盈盈[4]运用常用的筛选分离方法对自然发酵的发糕及其发酵米浆进行微生物分析,研究发现其中的优势菌株为乳酸菌和酵母菌。对于发酵米粉的应用主要为自然发酵和菌种发酵,且国内外较少发现用乳酸菌和酵母菌复合发酵米粉并对其香气进行研究的报道,而本文拟用胚芽乳杆菌和酿酒酵母菌对米粉进行复合发酵,期望得到风味极佳的发酵米粉。

不同制作工艺的发酵米粉会带来不同的口感,大米浸泡发酵时间过短会导致发酵不完全,发酵时间过长会容易混入杂菌导致米粉变馊[5]。本文采用自然发酵米粉中的优势菌株酿酒酵母菌和胚芽乳杆菌[6]作为发酵菌株,并探讨复合菌株配比、发酵时间、发酵温度、接浆量的参数,以弹性值和感官评价值为依据得到最佳的发酵米粉工艺,利用香气成分对发酵米粉进行评价,为后续发酵米粉的研究提供一定的依据。

质构特性和香味物质是评价发酵米粉的重要指标,发酵米粉的香气成分复杂、种类多样,许多文章已有报道[7-10]。利用顶空微萃取技术与气相色谱-质谱法联用技术,检测挥发性气味具有便捷、经济、灵敏度高等一系列优势。本研究采用手动固相微萃取法和气相色谱-质谱联用技术对自然发酵米粉和复合菌发酵米粉的香气物质进行提取和检测分析,以期得到其最佳的乳酸菌和酵母菌的复配比例和呈现香气的主要成分。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大米 湖南省衡阳金优大米厂,粉碎过90目筛;菌种:酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、胚芽乳杆菌(Lacbobacillusplantarum) 保存于南昌大学食品学院食品科学与技术国家重点实验室。

772N可见分光光度计 上海精科仪器有限公司;HSY2-SP电热恒温水浴锅 上海浦东物理光学仪器厂;SPX-250BSH-II生化培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司;FA2004电子天平 舜宇恒平仪器;TGL-15B离心机 上海安亭科学仪器厂;Universal TA质构仪 上海腾拔仪器科技有限公司;Agilent7890气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司;DVB/CAR/PDMS50/30 μm手动固相微萃取进样器 美国Agilent公司。

1.2 培养基的配制

黄豆芽汁培养基[11]:食用黄豆芽100 g、琼脂20 g、葡萄糖50 g,在洗净的黄豆芽中加入1000 mL蒸馏水,小火沸煮30 min,过滤,将水补足,加入葡萄糖,煮沸后加入琼脂,继续加热融化,分装包扎,在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min,备用。

MRS液体培养基[12]:牛肉蛋白粉15 g,醋酸钠5 g,硫酸镁0.58 g,柠檬酸二铵2 g,葡萄糖20 g,酵母菌浸出液4 g,硫酸锰0.28 g,吐温80 0.1 mL,蒸馏水1000 mL,pH6.2,在121 ℃下高压蒸汽灭菌备用。

1.3 胚芽乳杆菌和酿酒酵母菌培养条件的确定

1.3.1 胚芽乳杆菌培养条件优化 取10 mL预先配好的MRS液体培养基于锥形瓶中,并接种胚芽乳杆菌,分别在20、25、30、35、40 ℃条件下培养18 h,测OD值,确定最佳培养温度。

取10 mL预先配好的MRS液体培养基于锥形瓶中,并接种胚芽乳杆菌,并在上述得到的最佳培养温度下连续培养21 h,测OD值,每隔3.5 h测定一次,确定最佳培养时间。

1.3.2 酿酒酵母菌培养条件优化 取10 mL预先配好的豆芽汁培养基于锥形瓶中,并接种酿酒酵母菌,分别在20、25、30、35、40 ℃条件下培养20 h,测OD值,OD值与菌液中的微生物计数呈相关关系[13],可以通过测得的OD值来反应活菌数,确定最佳培养温度。

取10 mL预先配好的豆芽汁培养基于锥形瓶中,并接种酿酒酵母菌,并在上述得到的最佳培养温度下连续培养18 h,测OD值,每隔2 h测一次,确定最佳培养时间。

1.3.3 酿酒酵母菌与胚芽乳杆菌菌体的获取 取配好的黄豆芽培养基20 mL加入到200 mL的锥形瓶中,接种酿酒酵母菌,然后放入生化培养箱中,在上述实验获得的最佳条件下进行培养,取出,将三角瓶转移至无菌离心管中,4000 r/min离心30 min,使溶液分层,用生理盐水将菌种清洗,可制备出所需的纯酿酒酵母菌种。同上述方法,在MRS液体培养基中接种胚芽乳杆菌,进行培养、离心,制备所需的纯胚芽乳杆菌菌种。

1.4 发酵米粉的制作

大米预处理→磨粉→浸泡→接菌发酵→气蒸挤丝成型→老化→复蒸→洗粉切断→杀菌→冷却→计量包装→预检→复检成品[14-15]

将大米进行磨粉并过90目筛得到大米粉,称取10 kg制备的大米粉样品,加水15 mL,将米浆在紫外灯下灭菌,接入酿酒酵母菌与胚芽乳杆菌按一定配比得到的复合菌种，按1%的接种量直接接种到50 g米浆中,静置发酵30 min,得到发酵成熟米浆后,再次以一定的接浆量接入到无菌米浆中,在一定温度下发酵一定时间,将发酵好的米浆进行气蒸凝固,挤丝成型,再置于冷水中老化3 h,使米粉迅速成型以减少粘性,复蒸5 min使其更加有韧性,将复蒸好的米粉条直接放入水中进行清洗切条,用40 ℃热风干燥使米粉含水量达到10%,用紫外灯进行灭菌,冷却到室温,用密封袋进行包装,每袋250 g。以自然发酵米粉[16]所制得的米粉样品作为对照,命名为样品1,接种酿酒酵母菌与胚芽乳杆菌的复合菌发酵得到的米粉样品为样品2。

1.5 复合菌发酵米粉制作的工艺优化

1.5.1 单因素实验

1.5.1.1 菌种的不同配比对发酵米粉弹性值的影响 将上述所制备的胚芽乳杆菌与酿酒酵母菌菌体分别以1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1的比例配比,接种复合菌进行发酵得到成熟米浆,再以10%的接浆量接种到新鲜米浆中,在30 ℃发酵12 h,气蒸挤丝,确定胚芽乳杆菌与酿酒酵母菌的配比对发酵米粉质构的影响。

1.5.1.2 接浆量对发酵米粉弹性值的影响 将所制备的胚芽乳杆菌与酿酒酵母菌菌体分别以1∶1的比例配比,接种复合菌进行发酵得到成熟米浆,分别以5%、7.5%、10%、12.5%、15%、20%的接浆量接入新鲜米浆中进行发酵,在30 ℃发酵12 h,气蒸挤丝,确定接浆量对发酵米粉质构的影响。

1.5.1.3 发酵温度对发酵米粉弹性值的影响 将所制备的胚芽乳杆菌与酿酒酵母菌菌体分别以1∶1的比例配比,接种复合菌进行发酵得到成熟米浆,分别以10%的接浆量接入新鲜米浆中进行发酵,分别在20、25、30、35、40 ℃条件下发酵12 h,气蒸挤丝,确定发酵温度对发酵米粉质构的影响。

1.5.1.4 发酵时间对发酵米粉弹性值的影响 将所制备的胚芽乳杆菌与酿酒酵母菌菌体分别以1∶1的比例配比,接种复合菌进行发酵得到成熟米浆,分别以10%的接浆量接入新鲜米浆中进行发酵,分别在30 ℃条件下分别发酵4、8、12、16、20 h,气蒸挤丝,确定发酵时间对发酵米粉质构的影响。

1.5.2 正交试验 根据研究报道,设计正试实验表[17]。设计四因素三水平的正交试验,以菌种配比、接浆量、发酵温度、发酵时间作为四因素其三水平,据此设计正交试验,进行弹性值测定和感官评价。

表1 正交试验因素及水平表

1.6 指标的测定

1.6.1 OD值的测定 OD值直接用分光光度计进行测定[18],测定波长为410 nm,并做三次平行试验,取平均值。

1.6.2 弹性值的测定 取制作好的发酵米粉3根等间距放在P/36R探头的测定台上测定,质构仪测定参数设置:测定模式TPA;测定探头P/36R;下行速度6 mm/s;测定速度2 mm/s;上行速度6 mm/s;应变位移60%;引发力5 g;引发类型,自动;获取数率400PPS;记录质构仪显示的数据并分析图谱[19]。

1.6.3 感官评价方法 采用农业行业标准NY/T 1512-2014感官评价法对自然发酵和复合菌发酵的米粉进行感官评价,感官评价小组由20人组成,包括5位老师和15位学生,参与人员都经过专业感官品尝训练。从组织形态、色泽、滋味气味、杂质方面分别对发酵米粉进行感官评价,每项都有5个评分等级,根据评定成员对成品的喜爱程度分级,-2:极不喜欢;-1:轻度不喜欢;0:无所谓;1:轻度喜欢;2:极喜欢。

1.7 发酵米粉香气成分分析

1.7.1 顶空固相微萃取(HS-SPME)提取发酵米粉香气成分 分别将5 g的发酵米粉样品1、样品2移入到顶空瓶中,盖紧瓶盖,在60 ℃下水浴,平衡15 min,之后使用DVB/CAR/PDMS三层复合萃取头顶空吸附40 min,吸附时顶空瓶应一直处于水浴状态,取下萃取头,将水珠擦掉并接GC进样口,解析5 min,并做3次平行试验。

1.7.2 气相色谱-质谱分析发酵米粉香气成分 气相色谱条件[20]:色谱柱为HP-5MS,30 m×0.25 mm×0.25 μm;载气:氦气;柱子流速:1 mL/min;进样口温度:250 ℃;萃取头解析5 min,开始温度50 ℃平衡4 min,之后以4 ℃/min的速率达到150 ℃,升温10 ℃/min,终温250 ℃,平衡10 min。

质谱条件:离子化方式:EI;电子能量:70 eV;质量范围35～350 m/z,色谱-质谱接口温度:250 ℃,离子源温度:230 ℃;四级杆温度:150 ℃。

1.7.3 定性定量方法 定性是对气相色谱-质谱联用仪的计算机NIST质谱库进行检索,选择匹配度为85%以上的香气成分。定量是根据总离子流图由计算机采用峰面积归一化法计算相对含量。

1.8 数据分析

实验数据采用软件SPSS 19.0进行方差分析,采用OriginPro 8.0进行作图。

2 结果与讨论

2.1 胚芽乳杆菌和酿酒酵母菌培养条件的确定

2.1.1 胚芽乳杆菌发酵温度的优化 温度对胚芽乳杆菌生长状况的影响如图1所示,胚芽乳杆菌在20～30 ℃时的繁殖状况随着培养温度的升高而增大,当温度达到30 ℃时,胚芽乳杆菌的生长达到最大值,并且在25～30 ℃时,繁殖较为迅速,当培养温度继续升至35 ℃时,胚芽乳杆菌的生长呈下降的趋势。随着温度的升高,越来越适宜胚芽乳杆菌生长,因此生长繁殖速度也随之增大,当达到最适温度,繁殖速度也达到最大,温度继续升高,活动受到抑制,活菌数量也随之减小。胚芽乳杆菌需要在最佳的培养温度下生长,由本实验可得最佳的培养温度为30 ℃。根据研究报道,酿酒酵母菌的最佳培养温度为35 ℃[21],跟本实验较为相近。

图1 培养温度对胚芽乳杆菌生长的影响

2.1.2 胚芽乳杆菌发酵时间的优化 时间对胚芽乳杆菌生长繁殖的影响如图2所示,当时间在7 h内,胚芽乳杆菌的繁殖状况呈明显的上升趋势,在7～14 h内,繁殖速度增加,在14～17.5 h内繁殖速度达到最大;17.5 h之后,胚芽乳杆菌的繁殖状况呈下降的趋势。随着时间的增加,培养基内的胚芽乳杆菌的活菌数增加,越来越适应该培养基环境条件,繁殖速度也随着增大,当培养17.5 h时,活菌数基本达到稳定,代谢也达到最高峰,随着培养时间的增加,有害代谢产物增加,抑制胚芽乳杆菌的生存,繁殖也开始减小。由此可知,胚芽乳杆菌的最佳培养时间为17.5 h。

图2 培养时间对胚芽乳杆菌生长的影响

2.1.3 酿酒酵母菌培养温度的优化 温度对酿酒酵母菌生长繁殖的影响如图3所示,酿酒酵母菌的繁殖在20～35 ℃之间随着温度的升高而增加,在20～25 ℃时,繁殖速度较为缓慢,25～35 ℃时,繁殖较为迅速;当温度达到40 ℃时,培养一定的时间后有下降的趋势。随着温度的升高,越来越适宜酿酒酵母菌的生长,繁殖速度也随着增大,当达到最适宜温度,活菌数也最多,随着温度的继续升高,生长受到抑制,活菌数也随之较少。酵母菌的生长繁殖需要合适的温度,由此实验可得酵母菌的最佳培养温度为35 ℃。根据研究报道,酿酒酵母菌的最佳的培养温度为30 ℃[22],跟本实验较为相近。

图3 培养温度对酿酒酵母菌生长的影响

2.1.4 酿酒酵母菌培养时间的优化 时间对酿酒酵母菌生长繁殖的影响如图4所示,在酿酒酵母菌生长12 h之内,其生长速度较快;当培养时间超过12 h，生长速率基本为零,逐渐达到稳定期,在12～14 h活菌数稍有减少,并未真正达到稳定,当培养时间达到16 h时,达到最大繁殖量,生长繁殖稳定,16 h之后,酿酒酵母菌繁殖速率为零。由此可得酿酒酵母菌的最佳培养时间为16 h。

图4 培养时间对酿酒酵母菌生长的影响

2.2 单因素实验结果

2.2.1 菌种的不同配比对发酵米粉的影响 菌种的不同配比对发酵米粉质构特性的影响如图5所示,当胚芽乳杆菌与酿酒酵母菌的配比在1∶4～1∶2时,其弹性值是增加的,当菌种的配比在1∶2～4∶1时,弹性值明显减小,其中当菌种配比在1∶2～1∶1时,弹性值下降最为迅速,当酿酒酵母菌的比例大于胚芽乳杆菌时,所得到发酵米粉的弹性值较大,发酵可使淀粉结构发生变化[23],有利于淀粉的糊化,使得米粉的弹性增大,分析得酿酒酵母菌可能更利于淀粉的糊化,在最佳的菌种配比情况下,弹性才能达到最大值。由此可得,胚芽乳杆菌与酿酒酵母菌的最佳配比为1∶2。

图5 菌种的不同配比对发酵米粉弹性值的影响

2.2.2 接浆量对发酵米粉的影响 接浆量对发酵米粉质构特性的影响如图6所示,在接浆量为5%～10%时,米粉弹性值随着接浆量的升高而增大,当接浆量在10%～20%时,米粉弹性值随着接浆量的增大而减小,其中当接浆量为10%时,弹性值达到最大值,由此可得,发酵米粉工艺中的最佳接浆量为10%。

图6 接浆量对发酵米粉弹性值的影响

2.2.3 发酵温度对发酵米粉的影响 温度对发酵米粉质构特性的影响如图7所示,在温度在20～35 ℃时,随着温度的升高,弹性值也随之增大,当温度为35 ℃时,米粉的弹性值达到最大,当温度在35～40 ℃时,发酵米粉的弹性值开始下降,即在35 ℃时最适宜复合菌的发酵,在发酵过程中所产生的酶和酸使得米粉的性质发生一定的变化,促进米粉凝胶质构的形成[24]。发酵米粉需要在最佳的发酵温度下进行发酵,可得最佳的发酵温度为35 ℃。

图7 温度对发酵米粉弹性值的影响

2.2.4 发酵时间对发酵米粉的影响 时间对发酵米粉质构特性的影响如图8所示,在发酵时间在4～16 h时,随着发酵时间的增长,弹性值随之增大,在发酵时间为16 h时,发酵米粉的弹性值达到最大值,在发酵时间在16～20 h时,发酵米粉的弹性值减小,在发酵过程中,米粉中的脂肪被分解为游离的脂肪酸,导致米粉中的脂肪含量降低[25],随着发酵的时间增加,游离脂肪酸分解为低分子的醛、酮等物质,使米粉出现不良气味[26],有害的代谢产物的增加,也会抑制菌种的生长,使得米粉的弹性值下降。得到发酵工艺的最佳发酵时间为16 h。

图8 时间对发酵米粉弹性值的影响

2.3 复合发酵米粉制作的工艺优化

由表2可得,在四个影响因素中,对发酵米粉弹性值影响强弱为:菌株配比>发酵温度>发酵时间>接浆量,对发酵米粉感官评价值影响程度为:菌株配比>发酵时间>发酵温度>接浆量。经过数据分析可得弹性值的最佳组合为A1B2C1D2,感官评价的最佳组合为A1B3C1D2。A1C1D2相同;其中因子B接浆量对发酵米粉的弹性值和感官评价的影响均为最小,考虑到经济问题，选择接浆量相对较少的B2。因此,选择A1B2C1D2作为最佳组合,即菌种配比为1∶1,发酵温度为30 ℃,发酵时间为16 h,接浆量10%,在该最佳发酵工艺参数下其发酵米粉,其米粉弹性值可达到0.896,感官评分为1.198,均高于其他实验组合。

表2 正交实验结果与分析

对实验数据进行F检验,F<1

2.4 发酵米粉香气成分分析

由表3中数据可知,样品1的香气成分有10种,样品2的香气成分有高达18种,样品1中烷类和醇类含量较高,样品2中醇类和酯类含量较高,香气值大于1的香气成分为样品香气的主要成分,样品1香气成分大于1的有3种,分别为二十九烷(3.012%)、1,3,5,7-环辛四烯(2.891%)和苯乙醇(3.056%);样品2香气成分大于1的有6种,分别为1,1-二十二烷氧基十六烷(3.214%)、苯乙醇(20.365%)、乙酸乙酯(17.022%)、乙酸2-甲基丁酯(5.326%)、癸酸乙酯(3.025%)、壬酸乙酯(1.066%)。醇类物质是发酵食品中的一种重要的挥发性气味,有呈香的作用[27],样品13中的醇类物质只有一种为苯乙醇,样品2中的醇类物质有四种,分别为1-戊醇、庚醇、1-辛烯-3-醇、苯乙醇,与自然发酵米粉香气相比,复合菌发酵米粉香气成分中醇类物质含量和种类都较多,苯乙醇具有清甜的香味,是两个样品共有的香气成分,含量都较高,为主要的呈味物质,1-辛烯-3-醇具有干草香气,常用于香料的配制,为复合菌发酵米粉增加了香气。酯类物质是发酵米粉中种类最多的一类香气物质,对复合菌发酵米粉的香气有着重要影响,其中自然发酵米粉中未检测出酯类物质的存在,乙酸乙酯具有甜味,过高的含量会有溶剂的气味[28],是复合菌发酵米粉的主要香味物质,癸酸乙酯具有酒香气味,常作为调相剂食用,酯类赋予复合菌发酵米粉更为丰富的香气。由数据可知,通过复合酵母菌发酵的米粉风味更为丰富。

图9 样品1GC-MS图

图10 样品2GC-MS图

2.5 发酵米粉的感官

表4中,组织形态方面,自然发酵米粉呈现均匀、无杂质的状态,复合菌发酵米粉更能呈现出均匀的质地;色泽方面,自然发酵米粉呈现乳白透明状态,复合发酵米粉更能呈现通透的质地;滋味方面,自然发酵米粉呈现出弹性、米粉应有的滋味,复合发酵米粉的弹性口感更强;杂质方面,发酵米粉不应出现黑斑、霉点等杂质,自然发酵米粉和复合菌发酵米粉都能达到极少杂质的状态。由数值可知,在组织形态、色泽、滋味气味、杂质方面,复合发酵米粉的数值都高于自然发酵米粉,由综合评价的数值可知,复合发酵米粉的分值较高,其中复合菌发酵米粉1最受大众欢迎。

表4 发酵米粉感官评价

3 结论

本文通过OD值的测定来确定菌株的最佳生长条件,得到胚芽乳杆菌的最适生长条件为在30 ℃下培养17.5 h,酿酒酵母菌的最适生长条件为在温度35 ℃下培养16 h。通过弹性值的测定来确定发酵米粉的最佳发酵条件,在胚芽乳杆菌与酿酒酵母菌的比例为1∶1、接浆量10%、温度30 ℃发酵16 h,得到质构特性较好的发酵米粉,弹性值为0.902。采用手动固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术对自然发酵米粉和复合菌种发酵米粉进行香气成分分析,发现传统自然发酵的米粉的香气成分为10种,主要的呈味物质有三种,为醇类和烷类,不含酯类物质;而通过复合菌种发酵的米粉香气成分达18种,主要的呈味物质有六种,为酯类、醇类。与自然发酵米粉相比,复合发酵米粉的香气物质含量更高,种类更多,赋予复合菌发酵米粉更丰富的香气。感官评价中复合菌发酵米粉1分值最高,最受大众欢迎。由此可知,通过复合酵母菌发酵的米粉较传统发酵米粉有更为丰富的香气,为后续研究符合菌株发酵米粉的香气成分提供一定的实践经验。