响应面法优化机械砂磨辅助提取婆枣中原花青素工艺

程海涛,申献双

(1.衡水学院化工学院,河北衡水 053000;2.衡水学院美术学院,河北衡水 053000)

婆枣是产于河北地区的一种大枣,其适种性强,果实形状为长圆或倒鸡蛋圆形,大小齐整,果肉以青白颜色为主,口感脆而甜,汁多、果皮微薄、柔韧性差,成熟果实呈深棕红色。婆枣含有多种营养物质和天然成分,是营养与食疗保健的进补佳品,同时是一种具有益气填中、安神补血、调和药用的中药材[1]。

原花青素是一种抗氧化性极强的多酚类化合物,属于天然抗氧化剂,提取方法有溶剂浸提法、超声波辅助法、微波辅助提取法、超临界萃取法、生物辅助提取法等。刘琼等[2]利用超声波提取鸡蛋枣中的原花青素,利用单因素、响应面试验优化了提取工艺,提取率为1.82%,抗氧化实验证明性能优于VC。张娜等[3]通过传统蒸制方式,研究了蒸制时间对原花青素的影响趋势,利用高效液相测定其含量,结果表明高温会降低原花青素提取率。樊永红等[4]利用70%乙醇溶液作为提取剂,提取了新疆沙枣中的原花青素,利用正交试验优化了工艺,提取率达2.9 mg/g。徐亚维等[5]以山东小枣为研究对象,利用70%乙醇为提取剂,采用二次提取工艺提取了山东小枣中的原花青素,提取率接近1.89%。除此之外,研究人员利用溶剂浸提、超声波辅助、常压蒸馏等方法对山东小枣、骏枣、冬枣中天然成分原花青素等的含量、抗氧化清除自由基性能进行了相关研究报道[6-15]。但是利用机械砂磨强化河北深州婆枣中原花青素的提取工艺的研究未见发表,尤其是把机械砂磨引入天然成分提取尚属首次。

机械砂磨是一种利用研磨介质相互摩擦、碰撞,产生相应机械剪切力,减小物质粒径,破坏组织的物理性方法。机械砂磨具有对环境无影响、不产生污染物、破壁效率高、对有效物质的分子结构保护性高、能量消耗低等特点,对天然物质的破壁提取有一定的强化作用。

本研究首次利用机械砂磨技术,以深州婆枣为研究对象,利用响应面实验设计优化机械砂磨辅助提取深州婆枣中原花青素工艺,为深州婆枣在食品、化妆品等领域的综合利用提供坚实的理论基础和详实的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

婆枣 河北深州;甲醇、硫酸、无水乙醇 分析纯,西陇科学股份有限公司;香草醛 分析纯,天津市大茂化学试剂厂;原花青素标准品 纯度 99.9%,西陇科学股份有限公司。

SFJ-400砂磨、分散、搅拌(550 W)机 上海现代环境工程技术有限公司;研磨玻璃珠(2～5 mm) 衡水瑞丰化玻仪器有限公司;RE-52A旋转蒸发仪 日本东京理化公司;T6新型紫外-可见分光光度计 宁波欧普仪器有限公司;HH-S4型恒温水浴锅 北京市长风仪器仪表公司;TP-A100型电子天平 金坛市国旺实验仪器厂;AR1140型离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 深州婆枣中原花青素的提取工艺 新鲜深州婆枣切成块状,在温度为70 ℃烘箱里烘干至恒重[16],粉碎过35目筛子,待用。按照一定液料比配制婆枣颗粒-乙醇溶液1 L,加入一定体积研磨材料(2 mm玻璃珠),研磨一定时间,将溶液用200目筛网过滤,然后用定量滤纸过滤,最后经过离心机离心,将制备好的婆枣原花青素溶液进行原花青素含量测定。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 研磨时间对原花青素得率的影响 为了探究研磨时间与原花青素得率之间的关系,在研磨材料(玻璃珠)粒径2 mm,研料用量20%,研磨温度50 ℃,液料比20 mL/g,乙醇体积分数50%条件下进行试验,研究不同研磨时间5、10、15、20、25 min对原花青素得率的影响。

1.2.2.2 研磨材料粒径对原花青素得率的影响 在研磨时间15 min,研料用量20%,研磨温度50 ℃,液料比20 mL/g,乙醇体积分数50%条件下进行试验,探讨研磨材料1、2、3、4、5 mm粒径对原花青素得率的影响。

1.2.2.3 研料用量对原花青素得率的影响 在研磨时间15 min,研磨材料粒径3 mm,研料用量20%,研磨温度50 ℃,液料比20 mL/g,乙醇体积分数50%条件下进行试验,探讨研料用量分别为10%、20%、30%、40%、50%条件下对原花青素得率的影响。

1.2.2.4 研磨温度对原花青素得率的影响 在研磨时间15 min,研磨材料粒径3 mm,研料用量30%,液料比20 mL/g,乙醇体积分数50%条件下进行试验,探讨研磨温度分别为40、50、60、70、80 ℃对原花青素得率的影响。

1.2.2.5 液料比对原花青素得率的影响 在研磨时间15 min,研磨材料粒径3 mm,研料用量30%,研磨温度60 ℃,乙醇体积分数50%条件下进行试验,探讨液料比分别为15、20、25、30、35 mL/g对原花青素得率的影响。

1.2.2.6 乙醇体积分数对原花青素得率的影响 在研磨时间15 min,研磨材料粒径3 mm,研料用量30%,研磨温度60 ℃,液料比25 mL/g条件下进行试验,探讨乙醇体积分数分别为40%、50%、60%、70%、80%对原花青素得率的影响。

1.2.3 响应面试验 在单因素实验的基础上,选取婆枣原花青素得率为响应值Y(%),影响因素研磨粒径(直径)(X1),研磨时间(X2),乙醇体积分数(X3),研磨温度(X4)进行响应面实验设计,优化因素水平。响应面优化试验因素水平见表1。

表1 响应面试验设计因素与水平

1.2.4 原花青素含量的测定以及得率的计算

1.2.4.1 标准曲线的确定 称量原花青素标准品0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1 g,用分析纯甲醇试剂溶解于容量瓶中,定容至100 mL。根据香草醛-盐酸法[19]测量500 nm溶液处吸光度,绘制浓度-吸光度标准品曲线,经过回归拟合得到标准方程为:y=0.4514x-0.0356,R2=0.9996。

1.2.4.2 原花青素得率的计算 首先利用原花青素回归拟合标准曲线测定样品中原花青素浓度,具体方法如下:利用吸量管取1 mL提取液,放置于20 mL烧杯中,同时加入1%香草醛-甲醇与30%浓盐酸-甲醇溶液,体积分别为5 mL,在30 ℃水浴条件下恒温30 min,测量500 nm 波长处吸光度,根据原花青素标准曲线,计算浓度。

原花青素得率计算公式如下:

式中,V:提取液体积(mL);C:原花青素浓度(mg/mL);n:稀释倍数;W:婆枣干重(g)。

1.3 数据处理

根据Box-Benhnken的实验设计原理,通过SAS软件对数据进行处理与回归分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 研磨时间对婆枣原花青素得率的影响 由图1可知,随着研磨时间的增加,原花青素的得率逐渐增加,在研磨时间为15 min时,原花青素的得率达到最大值1.912%,继续增加研磨时间,原花青素的得率呈现下降的趋势。其原因在于,刚开始研磨,束缚婆枣中原花青素的结构没有被彻底破坏,能够在乙醇溶液中溶出的原花青素较少,当束缚结构被完全破坏，得率出现最大值,研磨时间再增加,研磨材料可能破坏原花青素结构,所以得率开始减少。综上所述,用于响应面试验的最适研磨时间为15 min。

图1 研磨时间对原花青素得率的影响

2.1.2 研料粒径(直径)对婆枣原花青素得率的影响 由图2可知,随着研磨材料粒径的增加,原花青素的得率逐渐增加,在研磨材料粒径为3 mm时,原花青素的得率达到最大值1.911%,研磨材料粒径继续增大,原花青素的得率呈现下降趋势。其产生的原因是,粒径越小研磨面积越大,与婆枣接触越充分,对其组织结构破坏越完全,使得越多的原花青素析出,得率越高。综上所述,用于响应面试验的最适宜研料粒径为3 mm。

图2 研料粒径(直径)对原花青素得率的影响

2.1.3 研料用量(体积比)对婆枣原花青素得率的影响 由图3可知,随着研磨材料用量的增加,原花青素的得率逐渐增加,在研磨材料用量为30%时,原花青素的得率达到最大值1.912%,研磨材料用量继续增大,原花青素的得率呈现平稳的趋势。原因在于,研磨材料粒径一定的情况下,用量越大，研磨面积越大,对于婆枣组织破坏程度越大,原花青素自由运动程度增加得率越大,用量达到一定程度研磨面积达到极值,得率不再显著增加而是趋于平稳,研料用量(体积比)确定为30%。综上所述,用于响应面试验的最适宜研料用量为30%。

图3 研料用量(体积比)对原花青素得率的影响

2.1.4 研磨温度对婆枣原花青素得率的影响 由图4可知,随着研磨温度的增加,原花青素的得率逐渐增加,在研磨温度为60 ℃时,原花青素的得率达到最大值1.913%,研磨温度继续增大,原花青素的得率呈现下降的趋势。主要原因在于,研磨温度升高会使分子运动速度加快,同时渗透、扩散、溶解速度加快,原花青素的提取量会增多;但是研磨温度过高导致原花青素氧化,结构被破坏，得率降低[17]。综上所述,用于响应面试验的最适宜研磨温度为60 ℃。

图4 研磨温度对原花青素得率的影响

2.1.5 液料比对婆枣原花青素得率的影响 由图5可知,随着液料比的增加,原花青素的得率逐渐增加,在液料比为25∶1 (mL/g)时,原花青素的得率达到最大值1.913%,液料比继续增大,原花青素的得率呈现平稳的趋势。这是因为液料比越大,溶液与原花青素接触面积越大,原花青素进入溶液量越多,得率越高,液料比增大一定程度,能够摆脱婆枣组织结构束缚进入溶液的原花青素完全析出,得率达到最大值,液料比再增加没有实际控制意义[18],液料比确定为25∶1 (mL/g)。综上所述,用于响应面实验的最适宜液料比为25∶1 (mL/g)。

图5 液料比对原花青素得率的影响

2.1.6 乙醇体积分数对婆枣原花青素得率的影响 由图6可知,随着乙醇体积分数的增加,原花青素的得率逐渐增加,在乙醇体积分数为60%时,原花青素的得率达到最大值1.912%,乙醇体积分数继续增大,原花青素的得率呈现下降的趋势。原因是,乙醇体积分数增加提高了溶液极性，有助于原花青素的析出,得率升高,根据相似相溶的原理，当乙醇溶液极性和原花青素分子极性一致时得率最大,当乙醇浓度再增大,婆枣中的脂溶性杂质将和原花青素将竞争与乙醇作用,影响原花青素分子析出,得率降低。综上所述,用于响应面实验的最适宜乙醇体积分数为60%。

图6 乙醇体积分数对原花青素得率的影响

2.2 响应面优化提取婆枣皮原花青素工艺

2.2.1 响应面试验结果及回归方程的确定 根据响应面实验设计测定得率,结果如表2所示,利用SAS软件对实验结果进行回归分析如表3,通过回归分析建立得率预测模型:

表2 响应面实验方案及结果

表3 回归方程方差分析结果

2.2.2 响应面交互作用分析 根据回归模型,将任两水平固定在零水平,可以得到另外两因素交互作用的响应面图及对应等高线图,反映了各因素交互作用对提取得率的影响。本研究中各因素交互作用见图7～图12。

图7 研磨粒径与研磨时间交互作用的响应面图

图8 研磨粒径与乙醇体积分数交互作用的响应面图

图9 研磨粒径与研磨温度交互作用的响应面图

图10 研磨时间与乙醇体积分数交互作用的响应面图

图11 研磨时间与研磨温度交互作用的响应面图

图12 乙醇体积分数与研磨温度交互作用的响应面图

由图7～图12可知,研磨粒径与研磨时间、研磨粒径与研磨温度、研磨时间与乙醇体积分数、研磨时间与研磨温度之间的交互作用显著(p<0.05),表现为图7、图9、图10、图11的等高线为椭圆形。对比各图可知,研磨粒径、研磨时间、乙醇体积分数、研磨温度对深州婆枣中原花青素的提取得率影响显著(p<0.05),表现为图7～图12的曲面都较陡。

2.2.4 响应面优化工艺实际验证实验 对拟合函数

模型进行求解,计算极大值,结果为:X1为3.12 mm,X2为16.16 min,X3为61.23%,X4为62.12 ℃,极大值Y为1.941%。根据响应面多元二次方程求解以及单因素实验得到最佳工艺为:研料粒径3 mm,研磨时间16 min,研料用量(体积比)30%,研磨温度62 ℃,液料比25 mL/g,乙醇体积分数61%。在最优工艺条件下进行3次实际实验验证,得率为:1.942%±0.001%,与拟合函数模型最大计算值相比相差很小,相对误差为0.052%,拟合函数模型是可用的。

利用乙醇溶剂浸提[5]、超声波[2]、蒸制法[3]、机械研磨法分别对大枣中原花青素进行提取,得率分别为1.81%、1.86%、0.9%、1.943%,机械研磨辅助提取法提取大枣中原花青素得率最高。

3 结论

机械砂磨辅助提取婆枣中原花青素优化工艺条件为:研料粒径3 mm、研磨时间16 min、研料用量(体积比)30%、研磨温度62 ℃,液料比25 mL/g、乙醇体积分数61%,在优化工艺条件下婆枣中原花青素得率为1.942%±0.001%。实际验证实验表明,预测回归方程模型预测最大得率与验证试验得率相对误差为0.052%,拟合函数模型是可用的。实验证明机械砂磨提取婆枣中原花青素是可行的,机械砂磨可以破坏分子间作用力,破除束缚组织中束缚原花青素的结构,有效提高原花青素提取率,另外机械砂磨属于机械性物理外力,不会引起污染,同时机械砂磨效率高、成本低,是实现产业化的可行性途径。