寒地鼠耳芥室内栽培技术

穆 丹 缪天琳 李秀霞 李春丰 姜 成

(1.佳木斯大学, 黑龙江 佳木斯 154007； 2.东北林业大学, 黑龙江 哈尔滨 150040)

鼠耳芥(Arabidopsisthaliana)，又名拟南芥、阿拉伯芥、阿拉伯鼠耳芥、阿拉伯草，为十字花科鼠耳芥属(拟南芥属)草本植物[1-4]。鼠耳芥分布于北美洲、非洲西北部以及欧亚大陆，我国云南、四川、湖北、安徽、江苏、山东、陕西、甘肃、内蒙古、新疆、西藏等地均有生长，一般生于平地、山坡、河边及路边。

植物界常见的模式生物包括玉米[7]、水稻[8]和鼠耳芥。20世纪90年代，鼠耳芥作为模式植物进入人们的视野[5-6]。遗传学家、植物学家和分子生物学家开始投入大量物力、财力，专注于鼠耳芥的研究。鼠耳芥植株细小，生活周期短，自交繁殖，拥有目前已知高等植物中最小的核基因组。它是第一个全部完成基因组测序的被子植物，是被誉为植物“果蝇”的有花植物研究模式材料[9-10]。鼠耳芥的研究成果为其它观赏植物和作物的研究提供了丰富信息，为未来在属、种、种群水平上的进化过程研究提供支撑，并且为遗传学和分子生物学的研究奠定了坚实基础[11-14]。然而，在以鼠耳芥为材料的试验进程中，培养好鼠耳芥是一个关键环节。由于鼠耳芥种子细小，对于生长环境要求严格，且不同地域培养环境有所差异，故如何培育出优质的鼠耳芥幼苗，掌握鼠耳芥的栽培和繁殖技术尤为重要。笔者经过长期实践，探索出一套适于鼠耳芥室内生长的栽培改进方法，以期为寒地鼠耳芥栽植提供详实的参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为Columbia生态型鼠耳芥种子(ArabidopsisthalianaColumbia)，由东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室提供。培养基为1/2 MS培养基。土壤基质由腐殖土、蛭石、珍珠岩按体积比5∶2∶2均匀混合而成。浇灌液为1/2 MS营养液。

1.2 培养方法

野生状态下，鼠耳芥为冬季生植物。其种子于秋季发芽，冬季时处于幼年期，花的分生组织于春季分化，夏季种子成熟、脱落，完成从生长、发育到繁殖的生命全过程，周而复始，年复一年。试验选用土壤点播法和无菌移栽法。

土壤点播法：土壤基质高温灭菌，灭菌后将腐殖土、蛭石、珍珠岩充分混匀，装入培养盆中，轻微震荡使盆土平整。盆土不可过满，培养盆边沿与土面的距离控制在1～1.5 cm为宜。盆土充分吸收水分后，将消毒后的种子点播于土壤基质表面(注意控制种子密度)。播种后，为保证温湿度，培养盆覆盖塑料薄膜。薄膜上均匀戳孔，以便于透气。播种培养盆置于培养室中进行人工光照培养。

无菌移栽法：将消毒后的种子均匀的平铺于1/2 MS培养基上，在超净工作台晾干后封口。封好的培养皿置于组织培养室进行人工光照培养。在组织培养室培养7～9 d，长出4片叶后移栽。土壤基质的灭菌、装盆、浸水等操作同土壤点播法。用镊子将4叶期的幼苗从培养基上轻轻地挑出，移栽于装有土壤基质的培养盆中，注意控制幼苗距离。培养盆上覆塑料薄膜，薄膜均匀戳孔，以便透气。移栽后的幼苗置于培养室中进行人工光照培养。

表1 不同培养方法下鼠耳芥生长发育状况

培养方法展叶期/d成活率/%始花时间/d开花时株高/cm莲座直径/cm果荚长度/cm每荚种子数生活周期/d土壤点播法7～99637～404.9～6.05.6～6.00.9～1.140～4768～72无菌移栽法4～510030～335.2～5.85.5～5.81.2～1.346～5561～69

2 结果与分析

2.1 种子处理与播种、移栽

鼠耳芥种子播种前需进行春化处理，置于4 ℃冰箱低温处理3～5 d。如种子在冰箱内储存时间超过3个月，则不需进行春化处理。

种子常带毒、带菌、带虫，播种萌发后可感染幼苗使其发病，成为传染源。故严格种子灭菌消毒是保证种苗生长发育和防治病虫害的有效方法。种子灭菌分物理消毒灭菌、生物制剂拌种以及药物消毒灭菌3种方法。本实验室选用药物消毒灭菌的方法进行鼠耳芥种子的灭菌消毒。取种子适量，置于1.5 mL离心管中，加入无菌去离子水洗涤、震荡数次，用移液器吸除上清液和漂浮的种子。向离心管中加入20%(v/v)的次氯酸钠进行种子消毒，震荡20 s，用移液器小心吸除上清液。再次加入无菌去离子水洗涤、震荡种子数次，吸除上清液。部分种子用于平铺于1/2 MS培养基上，置于组织培养室，进行无菌苗的培养；另一部分用于土壤点播法的播种。

用于种子播种和无菌苗移栽的土壤需进行灭菌。土壤灭菌消毒是一种快速、高效杀灭土壤中真菌、细菌、杂草、病毒及病害虫的方法，能够保证种苗的后续生长，提高种苗的品质。待播种的土壤基质经121 ℃高温灭菌30～40 min后，将腐殖土、蛭石、珍珠岩按照5∶2∶2的比例充分混匀，装入培养盆。将培养盆置于苗盘中，每个苗盘15盆。播种前先在苗盘内加入清水，水深1.5～2 cm。待土壤基质充分浸透后，方可进行播种。将消毒后的种子播于土壤基质表面，每盆5～6个点，控制种子密度不可过密，否则影响生长。播种后，覆盖塑料薄膜，置于培养室进行人工光照培养。薄膜上均匀戳孔，便于透气，且防止土壤基质产生霉菌。

运用无菌移栽法，用于移栽幼苗的土壤基质也需灭菌、装盆、浸水，其操作同土壤点播法。用镊子轻轻地挑出4叶期的幼苗(切勿损伤根部和茎段)，移栽于培养盆中，注意控制幼苗距离，不可过密。移栽后覆盖塑料薄膜，置于培养室进行人工光照培养。覆膜3～5 d，待缓苗成功后揭去薄膜。

2.2 不同培养方法下鼠耳芥的生长发育

鼠耳芥在土壤点播法和无菌移栽法2种不同培养方法下，生长发育状况见表1。由表1可知，无菌移栽法种子置于培养皿中进行人工光照培养，环境培养条件适宜，4～5 d即展叶，且无菌苗生长状况好、长势比较均一，能够为后续试验提供生长一致的种苗；1/2 MS培养基能够为幼苗提供生长所需营养，种苗成活率达100%；与土壤点播法相比，无菌移栽法培养的果荚长且种子数多。虽然移栽后需要4～5 d的缓苗时间，但由于移栽前幼苗生长健壮，移栽后缓苗迅速，生长发育周期相对来说较短，能够在较短的时间内获得试验用苗。土壤点播法，展叶期7～9 d，比无菌移栽法展叶晚；成活率96%，比无菌移栽法低；始花时间37～40 d，与无菌移栽法相比约晚7 d；生活周期68～72 d；此法种子直接点播于土壤中，培养室的相对湿度稍大时，土壤容易长菌，影响种苗的生长发育；植株长势不均一，受环境因素的影响较大。与土壤点播法相比，无菌移栽法培养的种苗展叶期和始花时间早，成活率高，每荚种子数多，植株整齐，长势均一，且生活周期短，能够在短期内获得试验用材料，缩短了试验周期，是一种简易高效的鼠耳芥培养方法。

2.3 培养条件

2.3.1光照条件

光照是鼠耳芥赖以生存的最终能量来源，是对其生长发育影响较深的环境因子之一。植物体将光能转化成化学能，满足生长发育的需要。本实验室通过长期实践，发现鼠耳芥生长发育的光影响因素主要包括光照强度和光周期。培养室中光照强度一般通过开关灯管的数量来调节，以120～150μmol·(m2·s)-1为宜。鼠耳芥为长日照植物，培养室一般采用16 h光照和8 h黑暗的培养条件。但幼苗期的鼠耳芥不耐强光，故生长初期应提供8 h光照和16 h黑暗的短日照培养。生长至3～4周时依据植株生长情况，也可提供10 h光照和14 h黑暗的培养条件。短日照有利于鼠耳芥的营养生长，长日照和连续光照下促进鼠耳芥的生殖生长，花期提前，但植株叶片数量减少、种子生成受到抑制。故可根据试验需要，调节光照强度和光照时间。此外，为促进鼠耳芥的生长，可适当补充黄色光源。

2.3.2温度条件

寒地早晚温差大，秋冬季节温度低，各季节温度变化大，不利于鼠耳芥的生长。培养室的温度由中央空调严格控制，温度范围以20～25 ℃为宜。长期试验表明，营养生长期温度以22 ℃最佳，植株健壮，叶片大且厚；生殖生长期温度以25 ℃最佳，同时延长光照时间，可以促进开花结实。培养室应避免空调故障和长时间断电，否则影响鼠耳芥生长发育。温度过高，花的形态发育不正常，花苞容易枯萎而败育，严重影响开花结实。高温下，即使结实，果实多细弱、欠饱满，种子发芽率降低。鼠耳芥的耐受温度为28 ℃，但年老的植株耐受高温的能力增强，水分充足时甚至可耐受30 ℃以上的高温[15-16]。

2.3.3水分条件

水分条件是影响寒地鼠耳芥培养的重要因素之一。水分条件包括空气相对湿度和培养土湿度。鼠耳芥喜湿润，培养室的空气相对湿度控制在30%～75%为宜，以60%为最佳。不同生长期，对于空气相对湿度的需求存在差异。生长期，空气相对湿度宜高，有利于植株生长。结实期，需降低空气相对湿度，以利于种子的快速成熟。且结实期植株下部叶片衰老，湿度过大，易发生霉变，污染种子。

鼠耳芥不耐干旱，需保持培养土的微湿润。培养盆置于苗盘中，向苗盘中注入清水。通过毛细管自下而上地吸水，满足植株的水分需求。每次浇水，水深控制在1.5～2 cm之间，不可过深过频，影响寒地鼠耳芥生长。苗盘见干后，才可再次浇水。培养土湿度的控制，随着生长发育进程而不断变化。种子萌发需要较高的湿度，故播种后覆盖塑料薄膜，以确保培养环境的湿润度。覆膜揭除后的幼苗期，不定期向植株进行喷雾，依植株和土壤的干湿程度，确定喷雾量。生殖生长期，停止喷雾，控制每次的浇水量。果荚变黄后，停止浇水，以利于种子的采收。保持空气相对湿度和培养土湿度的同时，还需注意培养室的通风，以免产生霉菌，影响种苗品质。

2.3.4肥分管理

为促进鼠耳芥生长，栽培过程中应施加适量的营养液和复合肥。鼠耳芥培养期间每周施加1/2 MS营养液1次，每2周施加0.3%复合肥1次，尤其是幼苗期和抽薹期的肥分管理更为重要。1/2 MS营养液pH值控制在5.6～5.8范围内，将配制好营养液加入托盘，使营养液由培养盆底部的孔上渗，避免直接浇灌对于植株的冲击作用。营养液和复合肥切勿过量，否则易产生“烧苗”现象，影响生长发育。

2.3.5种子采收与保存

鼠耳芥种子着生于长角果内，长角果由绿色变为黄色，最终变为褐色，种子逐渐成熟。种子的收获方法包括单个长角果剪落收获、套袋收获以及商业化大规模收获。实验室主要采用单个长角果剪落收获和套袋收获两种少量收获的方法。其目的主要是保存种质，用于后续研究和试验。

试验表明，当长角果变为褐色时，种子成熟，是采收的最佳时期。种子采收时，用锋利的剪刀将成熟长角果剪下，置于干净的白纸上，然后轻缓地搓揉长角果，待种子完全洒落于白纸上，用灭菌后的镊子将种荚果壳挑取干净，最后将种子置于1.5 mL离心管中，装入硅胶干燥剂，封口，在离心管外壁上标记名称、收获时间等信息。收获的种子先放置在4 ℃冰箱中，7 d后转入-20 ℃冰箱保存。应用此法保存的种子，一年后仍可保持95%以上的发芽率。为避免种系混杂，可选用套袋收获法采集种子。在种子即将成熟前，用硫酸纸袋套住整个花序并封口，采收时沿基部剪下花序，轻缓搓揉后种子洒落于袋内，去除种荚果壳等杂质，干燥、封装、保存步骤同单个长角果剪落收获法。

温度和含水量是影响鼠耳芥种子保存的重要因素。温度越高，含水量越多，则种子寿命越短。为延长种子的寿命，可改变贮存条件。根据种子贮存的目的，保存方法分为短期、中期以及长期保存，可依据自身需求，选择适宜的保存方法。

2.3.6病虫害防治

为了培养健康、优质的鼠耳芥植株用于后续的遗传转化、突变体筛选、基因芯片及基因测序等遗传学和分子生物学试验，还需加强病虫害防治工作。培养室内的鼠耳芥常常遇到虫害、菌害以及苔藓、藻类的滋生。虫害以蚜虫、蓟马、蘑菇蝇、白粉虱、红蜘蛛、叶螨、白蝇为主，病害多为白粉病、灰霉病。防治鼠耳芥病虫害的原则是以防为主，以治为辅，防治结合。定期对培养室进行消毒、灭菌，用10%的漂白粉溶液刷洗地面，用70%的酒精擦拭培养架、栽培用具，或用45%的百菌清烟剂薰治，或升温至55 ℃持续24 h处理培养室，可有效地杀灭霉菌孢子和虫卵。使用安全、无公害的生物发酵制品护花神花卉病虫清(稀释200倍)进行喷洒和灌根处理，防治鼠耳芥的虫害和病害。在病虫害防治的过程中，应有效控制处理时间和药物浓度，以免对鼠耳芥植株造成不可逆的伤害。通过控制浇水量、定期松土、加强通风，可以有效解决苔藓、藻类的滋生。此外，培养室内悬挂环保捕虫板，可以诱杀蘑菇蝇、白粉虱等害虫。感染病虫害的植株应迅速全部移除，严防病虫害的传播。

3 讨论与结论

寒地城市日照时间短，冬季漫长且寒冷、干燥，昼夜温差大，季节变化明显，不利于鼠耳芥的生长发育。对比土壤点播法和无菌移栽法发现，土壤点播法培养的植株生长周期较长，长势不太一致，且成长过程中受到光照、温度、土壤等环境因素的影响过大，需要更加精细地管理，从而耗费时间和人力。由土壤点播法培养的幼苗较为娇弱，容易感染病害、虫害。实验室改进的无菌移栽法培育出的鼠耳芥，初期由培养皿移栽到土壤基质时较为健壮，缓苗后对于环境的适应能力强，再加上后期细致的苗期管理，植株健壮、整齐、长势一致。目前，已形成完善、简易、高效的鼠耳芥室内无菌移栽方法，能够为后续的试验提供优质材料。

基于寒地的气候和实际环境条件，有效调节培养室的光照、温度、湿度、肥水等是鼠耳芥培养的关键。移栽初期的小苗应避免强光，否则叶片褐化，生长受到抑制。此时，应减少光强和光照时间。随着植株逐渐长大，逐步由短日照变为长日照。夏季温度较高，当温度超过30 ℃时，鼠耳芥抽薹早，花序矮小细弱，影响种苗品质，所以应严格控制室内温度。冬季培养室内有供暖设施，有利于鼠耳芥的生长，植株更为强健。培养室的昼夜温差控制在4～5 ℃为宜。植株结实后，应严格控制空调的风速和风向，以免造成种子洒落和品系混杂。此时，应使结实植株远离空调，且置于培养架的下部位置，以免种子洒落到其它种植盘中。培养室应加强通风，否则湿度大和过量供水时都容易滋生真菌、藻类和苔藓。为保证品系的纯化，防止各品系间杂交，应注意各品系间的距离。且成株期应及时采取立棍绑苗措施，防止植株倒伏和相互间的接触。实践表明，有效地调控培养室的光照、温度、湿度、肥水等环境条件，辅以严格地栽培和管理措施，改进的寒地无菌移栽法能够优质高效地培养出鼠耳芥种苗满足后续的实验需要。