血清microRNA-224-3p在结直肠癌中的表达及临床研究*

朱 莹，王亚南

(1.苏州市立医院检验科，江苏苏州 215000；2.苏州市第九人民医院病理科，江苏苏州 215000；3.南京医科大学附属苏州医院检验科，江苏苏州 215002)

结直肠癌在世界范围内的发病率一直处于增高状态，过去几年的研究数据显示，结直肠癌的发病率在我国也一直居高不下[1]，是威胁全世界人民身体健康和生命安全的恶性肿瘤之一。我国人民生活水平的提高、饮食结构的改变、环境的恶化等原因使得结直肠癌的发病率逐年上升。由于研究者不停地对分子生物学进行深入研究，新近发现了许多microRNA(miRNA)与多种肿瘤性疾病的发生、发展、病情恶化有密切的关系。miRNA是一类小的、非编码的、内源性RNA片段(18～24个氨基酸的长度)，通过调节基因表达参与多种细胞内过程，在进化程度上高度保守，广泛存在于动植物中。miRNA可直接靶向mRNA，1个miRNA可调控多个mRNA，相对的，1个mRNA也可被多个miRNA调控。miRNA的作用机制为成熟的单链miRNA可通过碱基互补配对的方式与靶基因的mRNA的3′UTR端结合，若二者可以完全互补时，miRNA可将mRNA互补区特异性降解从而改变基因的表达，若二者不可以完全互补时，miRNA可通过与靶基因的mRNA3′UTR碱基互补配对，来阻止mRNA转录后翻译过程[2]，进而影响基因调控的表达，这二者的机制也可以相互融合，当完全互补时，直接切割掉mRNA，影响其表达。自1993年LEE等[3]在分析秀丽隐线虫的遗传学信息时发现第一个miRNA，并将其命名为Lin-4开始，截至2013年6月，已先后发现30 424个成熟的miRNAs(数据来源于miRBASE20版，截止时间为2013年6月)。而在人类基因组中已发现约1 000个miRNAs[4]。查阅文献可知，miRNAs与结直肠癌的发生、发展密切相关[5]，在文献中初步得知，miR-224-3p的表达量与结直肠癌的发生、发展有关[6]，本实验就miR-224-3p的表达通过荧光定量PCR(SYBR Green法)来检测，并研究其表达量与结直肠癌的临床病理关系。

1 材料与方法

1.1材料 选择苏州市立医院本部结直肠癌患者的住院血清标本共50例，其中男性标本29例，女性标本21例，临床病理资料见表1。健康人血清标本44例(健康对照组)，来源为苏州市立医院本部体检健康者的标本。本研究通过苏州市立医院医学伦理委员会的批准，患者签定知情同意书。采血容器是一次性真空采血管，保证使用统一的采血方法采集样本，在结直肠癌患者手术前空腹抽取5 mL静脉血，体检健康者也空腹抽取5 mL静脉血，将抽取的血清10 000 r/min离心处理10 min，移取上清液至另一新的离心管中，在-80 ℃下存储。组织标本离体后在10 min 内放在液氮罐内快速冷冻后置-80 ℃冻存。

1.2诊断、纳入和排除标准 诊断标准：所有患者依据肿瘤病理诊断规范(结直肠癌)[7]，经2名主治以上的病理科医生诊断为结直肠癌。纳入标准：(1)均按照WHO病理分期对其进行病理学检查后确定为结肠癌的患者，其临床病理分期采用TNM分期；(2)患者之前均未进行手术及放射性治疗；(3)本研究通过医院医学伦理委员会的批准，患者签定知情同意书；(4)临床病理参数及随访资料完整的患者。排除标准：(1)术后病理提示良性肿瘤的患者；(2)结直肠有溃疡或结直肠炎患者；(3)有其他恶性肿瘤病史的患者；(4)临床病理资料缺失以及失访者。

1.3仪器与试剂 本实验所采用的主要试剂为Trizol试剂、总RNA提取试剂、RNase Free ddH2O、miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRcute miRNA荧光定量PCR(SYBR Green)检测试剂盒，均购自天根公司，下游引物是由miR-cute miRNA荧光定量PCR检测试剂盒配套的，miR-224-3p上游引物的目录号为CD201-0306，miR-16上游引物的目录号为CD-0235，均购自天根公司。本实验所采用的仪器PCR System7500扩增仪购自美国ABI公司，Eppendorf高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司，超低温冰箱及生物安全柜均购自上海瑞仰公司。

表1 结直肠癌患者的临床病理资料

1.4标本总RNA的提取 取30 mg组织样本加入1 mL Trizol(天根公司),进行匀浆处理,按说明书中的操作步骤提取RNA。血清250.0 μL加入Trizol 750.0 μL并放在震荡仪上混匀，再按照说明书的操作步骤提取RNA。选用总RNA吸光度(A260/280nm)比值在1.8～2.2的标本。

1.5miRNA 3′末端加Poly(A)处理和逆转录反应 根据天根公司提供的 miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒说明书对miRNA 3′末端进行Poly(A)加尾处理。反应的总体系共20.0 μL，各组分成分分别为Total RAN 2.0 μL、E.coli Poly(A) Polymerase(5 U/μL)0.4 μL、10×Polymerase buffer 2.0 μL、5×rATP Solution 4.0 μL、RNase-Free ddH2O 11.6 μL。轻轻混匀后，进行短暂离心，在37 ℃反应60 min。再根据天根公司提供的说明书对加尾处理后的miRNA进行逆转录反应。反应总体积为20.0 μL，各组组成成分分别为Poly(A)反应液2.0 μL、10×RT Primer 2.0 μL、10×RT Buffer 2.0 μL、Super Pure dNTPs(2.5 mmol/L each)1.0 μL、RNasin(40 U/μL)1.0 μL、Quant RTase 0.5 μL、RNase-Free ddH2O 11.5 μL，轻摇使之混合后，进行短时间的离心，在37 ℃的条件下反应60 min，随后将合成的cDNA反应液保存于-20 ℃的条件下。

1.6荧光定量PCR 按照miRcute miRNA荧光定量PCR检测试剂盒的说明书进行miRcute miRNA荧光定量PCR检测试剂的配制，反应总体系一共20.0 μL，各组分分别为2×miRcute miRNA Premix(含SYBR，含ROX)10.0 μL、Forward Primer 0.4 μL(10 μmol/L)、Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μL、miRNA第一链cDNA 2.0 μL、50×ROX Reference Dye 2.0 μL、ddH2O 5.2 μL，在PCR System7500扩增仪上进行循环扩增，扩增的循环参数为94 ℃预变性2 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，共43个循环。扩增结束后，将每个反应管中标本的荧光信道达到阈值时所对应的循环数(Ct值)记录下列，用miR-16作为内参物[8]。通过归一化处理目标基因，以确保样品量与目标基因量的一致性。其结果采用2-ΔΔCt法[9]进行计算分析。用25 g/L琼脂糖凝胶对10.0 μL扩增产物进行电泳，观察电泳效果并拍摄结果。

2 结 果

2.1溶解曲线 miR-16和miR-224-3p的溶解曲线均为尖锐的单峰，出现峰值的温度分为78.05 ℃和77.91 ℃。此结果说明该引物具有特异性，数据可用。

2.2电泳图 组织和血清中的miR-16和miR-224-3p经PCR扩增仪扩增后的产物在2.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳，结果均见到清晰的电泳条带，表示扩增有结果。miR-16作为内参分子，其相对分子质量大小为79 bp，miR-224-3p的相对分子质量大小为80 bp，大小符合，见图1、2。

2.3miR-16的PCR扩增结果 健康对照组血清miR-16的Ct值为30.32±0.66，结直肠癌组miR-16的Ct值为29.83±0.59，符合正态分布，miR-16在两组中稳定表达，可作为定量检测miRNA的内参基因。

注：1表示miR-224-3p阴性对照，2～7表示miR-224-3p，8表示miR-16阴性对照，9～14 表示miR-16

图1组织中miR-16和miR-224-3p的电泳图

注：1表示miR-224-3p 阴性对照，2～7表示miR-224-3p，8～13 表示miR-16，14 表示miR-16阴性对照

图2血清中miR-16和miR-224-3p电泳图

2.4血清miR-224-3p的相对表达量 健康对照组中血清miR-224-3p的Ct值为37.19±0.97，结直肠癌组中血清miR-224-3p的Ct值为32.97±0.68，血清miR-224-3p在结直肠癌组中的相对表达量确实增长。对其结果采用2-ΔΔCt法进行计算分析，用[M(P25～P75)]来表达血清miR-224-3p的相对表达水平，进行非参数Wilcoxcon秩和检验，差异有统计学意义(P<0.05)，血清miR-224-3p在结直肠癌组和健康对照组中的表达有差异。见表2、图3。

表2 血清miR-224-3p在健康对照组和结直肠癌组中相对表达量的比较[M(P25～P75)]

图3 血清miR-224-3p在健康对照组和结直肠癌中

2.5血清miR-224-3p的相对表达水平与结直肠癌患者各临床病理学的关系 血清miR-224-3p的相对表达水平在结直肠癌患者的性别、年龄、肿块大小、淋巴结是否转移、TNM分期、癌症的分化程度中，差异无统计学意义(P>0.05)，即血清miR-224-3p的相对表达水平与结直肠癌患者的性别、年龄、肿块大小、淋巴结是否转移、TNM分期、癌症的分化程度没有关系。而在不同预后情况以及与癌胚抗原表达水平中，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 血清miR-224-3p的相对表达水平与各临床病理学的关系[M(P25～P75)]

3 讨 论

癌胚抗原检测、粪便隐血试验在临床上广泛用于消化道肿瘤的诊断，但其存在灵敏度低、易受其他非特异性疾病影响等缺点，其检测灵敏度和特异度均低。而结直肠镜检测虽然是结直肠癌检测的金标准，但患者承受的痛苦大，普遍接受度低，难以广泛开展，血清检测miRNA是一种新型的非侵入筛查试验，对于检测结直肠癌具有显著意义[10]。有大量研究表明，抑癌基因的抑制和癌基因的激活对结直肠癌的发生、发展有密切关系，而血清miR-224-3p在结直肠癌患者中所扮演的角色是充当癌基因的作用，能促进结直肠癌的发生、发展[11]。查阅文献可知，高表达的miR-224通过抑制PHLPP1和PHLPP2来促进细胞的增殖和肿瘤的生长[12]。miR-224可以与PHLPP1和PHLPP2基因的mRNA的3′UTR结合，从而抑制PHLPP1和PHLPP2基因的表达，由于高表达的PHLPP1和PHLPP2对miR-224介导的磷酸化的AKT和FOXO3a通路可产生抑制，同时阻止miR-224对细胞周期调控因子P21、P27以及细胞周期蛋白D1的调控[13-14]，因此,miR-224抑制了PHLPP1和PHLPP2基因的表达，调控细胞周期，使细胞发生癌变。Maspin基因在肿瘤转移中起抑制作用，但miR-224可以抑制Maspin基因来促进肿瘤细胞的转移[13]。miR-224也可以通过促进KRAS基因[14]、抑制SMAD4基因[15]来促进肿瘤细胞的生长。因此,miR-224可促进肿瘤细胞的生长、发育、繁殖和转移。

本实验采用荧光定量PCR检测苏州市立医院本部结直肠癌患者的住院血清标本共50例，健康者血清共44例，研究发现血清miR-224-3p的相对表达水平在健康对照组和结直肠癌组差异有统计学意义(P<0.05)，在结直肠癌血清中的表达水平约为健康对照组的2倍，提示miR-224-3p在结直肠癌患者的血清中呈高表达，这与LI等[16]报道相符。miR-224-3p在结直肠癌患者的表达水平高于健康对照组，提示今后可通过检测血清miR-224-3p的表达水平对结直肠癌患者进行辅助诊断。

对结直肠癌患者的具体病理参数进行进一步分析发现，miR-224-3p在结直肠癌患者中的表达水平与性别、年龄、肿块大小、淋巴结是否转移、TNM分期和分化程度均无关，与患者癌胚抗原水平有关。本实验中发现，在不同的癌胚抗原水平组中，血清miR-224-3p的表达水平有差异(P<0.05)，患者癌胚抗原水平高，其血清miR-224-3p的表达水平也高，所以，可将miR-224-3p和癌胚抗原联合检测，弥补癌胚抗原检测时的缺陷，以提高诊断的准确性。miR-224-3p有望成为评估结直肠癌的重要指标。

本实验研究还发现，血清miR-224-3p在不同预后组中的表达有显著性差异(P<0.05)，miR-224-3p在预后好的相对表达水平是预后差的2倍多，但是查阅文献均得知miR-224-3p相当于癌基因的作用[6]，其表达上调[17]，与本实验在不同预后组中表达水平相反，推测原因可能是预后差的结直肠癌患者血清中有干扰miR-224-3p活性的物质。因此，在下一步课题研究中，笔者将进一步扩大样本量，探讨miR-224-3p在结直肠癌患者预后判断中的作用。在本研究中并未涉及miR-224-3p的调控机制，在之后的实验中有待更深入的研究。

4 结 论

本研究发现，血清miR-224-3p在结直肠癌患者的血清中呈高表达，可用于结直肠癌患者的辅助诊断，减少患者筛查结直肠癌的痛苦，与癌胚抗原联合检测，可弥补癌胚抗原筛查结直肠癌时的灵敏度低和特异度低的缺陷，以提高诊断结直肠癌的准确性。同时，血清miR-224-3p可用于结直肠癌患者的预后判断。