氧化应激影响肝癌细胞糖异生关键基因表达的作用

肖 靖，胡泽明，康川川，袁邵强，周雯娜，黄 菲，陈 斌，钟田雨，钟佳宁

(赣南医学院 1.2016级本科生；2.2017级硕士研究生；3.2016级硕士研究生；4.2015级本科生；5.科研中心;6.第一附属医院,江西 赣州 341000)

氧化应激(Oxidative stress)是指在病理状态下，活性氧产生量超过了内源性抗氧化防御系统的清除能力，过多的自由基(如羟基自由基，超氧阴离子)堆积，使宿主一些生物大分子物质，如DNA、脂质、蛋白质等产生氧化作用[1]。普遍认为，氧化应激的异常升高在体内可能产生一种负面作用，并被认为是导致衰老和慢性疾病(心血管疾病、动脉粥样硬化、代谢紊乱等)的一个重要诱导因素[2]。糖异生主要在肝[3]、肾[4]、小肠[5]中等通过一系列酶促反应利用代谢中间产物(如乳酸、丙酮酸、甘油、生糖氨基酸等)重新合成葡萄糖，以维持空腹机体的基础血糖水平。在空腹状态下肝脏通过糖异生输出葡萄糖量约占全身血糖供应量的65%[6]，因此在肝细胞(包括肝癌细胞)中糖异生反应对血糖水平的调控(包括吸收血糖、糖原转化和糖异生及输出)具有重要作用。各种病因导致的肝脏氧化应激水平升高常引起糖代谢异常，而糖代谢异常则影响肝脏疾病本身的病程进展和预后[7]。因此，我们深入研究氧化应激如何调控糖代谢的作用机制有重要的意义。

GLUT4和G6PC两个关键基因在调控糖异生反应中起着重要作用。其中，GLUT4蛋白在肝癌细胞中具备类似于骨骼肌、心肌的应激转运能力,其能够在应激状态下负责葡萄糖转运并在肝糖原的快速恢复过程中扮演着重要角色[8]。研究表明，在负责葡萄糖转运的葡萄糖转运蛋白家族(Gluts)中唯有成员GLUT4能够在机体应激状态下担任葡萄糖转运工作，提供机体在应激状态下所需的能量。GLUT4总蛋白水平与肝糖原浓度存在反比关系,即当肝糖原浓度较低时GLUT4存在过表达,而肝糖原浓度较高时GLUT4低表达[9]。而葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)在糖代谢中也是参与糖异生和糖原分解过程的关键酶之一，广泛分布于糖异生活跃的器官与组织中[10]。G6Pase可催化糖异生和糖原分解中的最后一步反应，是肝葡萄糖生成的最后一步关键酶。

在肝脏中有多种转录因子可以调控G6PC基因和GLUT4基因的表达。FOXO家族的一个关键成员，即叉头转录因子(Forkhead box O 1，FOXO1)便是第一个被证明有此功能的转录因子[11]。在肝脏中，胰岛素可以通过激活AKT抑制肝糖异生[12]，激活的AKT随后在多个位点使FOXO1磷酸化，磷酸化的FOXO1与某些伴侣蛋白有更高的结合力，以便FOXO1从细胞核转移到细胞质，结果导致糖异生被抑制[13]。另有研究表明，FOXO1可以调节多种细胞活动如细胞凋亡与自噬、免疫调节及能量代谢[14]。FOXO1蛋白还参与其他的多种细胞功能，比如细胞增殖、衰老及对糖异生的应激抗性[15]。因此，FOXO1也是维持细胞生命活动的关键转录因子。

本研究拟通过H2O2处理HepG2肝癌细胞，模拟细胞氧化应激环境，观察其在肝癌细胞中如何调控糖异生基因(G6PC、GLUT4)的表达变化并揭示其潜在作用机制。通过该研究能够发现肝癌细胞中氧化应激对糖异生基因的影响，有助于深入了解肝癌细胞的代谢调控过程，为进一步研究氧化应激如何诱导相关肿瘤代谢机制提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1细胞与主要试剂HepG2细胞株从中国科学院细胞库购得。实验所需主要试剂有RPMI1640完全培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素和细胞裂解液Trizol(美国Invitrogen公司)；30%H2O2(武汉纯度生物公司)；SYBR Green试剂(美国Roche公司)；FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(美国Fermentas公司)；兔抗G6PC、GLUT4和FOXO1抗体(美国Millipore公司)；鼠抗β-actin抗体、辣根过氧化物酶偶联鼠抗和兔抗(美国Sigma公司)；荧光羊抗兔偶联抗体(美国Abcam公司)。qRT-PCR引物序列：G6PC.S GCAGGTGTATACTACGTGATGGT, G6PC.A GACATTCAAGCACCGAAATCTG；GLUT4.S GGGAAGGAAAAGGGCTATGCTG, GLUT4.A CAATGAGGAACCGTCCAAGAATG。

1.2细胞培养及药物处理HepG2细胞在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，其培养基用RPMI1640完全培养基(10%小牛血清、100 μg·mL-1青霉素和100 μg·mL-1链霉素)，每2天进行传代或保种。对照组用RPMI1640培养基处理，实验组用配制好的H2O2(0 mmol·L-1、1 mmol·L-1、2 mmol·L-1、4 mmol·L-1)处理。

1.3实时荧光定量PCR(qRT-PCR)将HepG2细胞传于6孔盘，在对数生长期给药处理，分为浓度梯度组2 h(0 mmol·L-1、1 mmol·L-1、2 mmol·L-1、4 mmol·L-1)和时间梯度组2 mmol·L-1(0 h、1 h、2 h、4 h)两组。给药完成后消化细胞，取细胞沉淀用细胞裂解液(Trizol)提取RNA，并检测RNA浓度和纯度，用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA后通过SYBR Green试剂进行PCR扩增，再用GraphPad软件进行数据处理。

1.4WesternBlot将HepG2细胞传于6孔盘，在对数生长期给药处理，分为浓度梯度组2 h(0 mmol·L-1、2 mmol·L-1、4 mmol·L-1)和时间梯度组2 mmol·L-1(0 h、2 h、4 h)两组。给药完成后消化细胞，取细胞沉淀制备成蛋白样品，上样、SDS-PAGE凝胶电泳、以250 mA恒流90 min转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入G6PC、GLUT4或者β-Actin抗体，4 ℃过夜。TBST轻洗3次遍后加入二抗室温孵育90 min，再用TBST清洗3遍后加入发光剂、显影、定影，定量分析H2O2处理前后G6PC和GLUT4的蛋白表达。

1.5免疫荧光实验备好灭菌的盖玻片置于6孔盘中。将HepG2细胞传于6孔盘中的6个格孔，使细胞贴壁于盖玻片上，并将其分为3个对照组(RPMI1640处理)和3个实验组(2 mmol·L-1H2O2处理)。在盖玻片上生长的细胞用4%冰甲醇固定保持5 min，并用5%BSA/PBS封闭30 min。然后用一抗孵育细胞常温1 h，再用PBST清洗3次，每次10 min。随后，用荧光偶联二抗孵育并进行相同的洗脱过程，最后用DAPI染核并洗脱，封片然后通过共聚焦显微镜下进行观察。

2 结 果

2.1H2O2对糖异生关键基因G6PC和GLUT4转录表达的影响在H2O2处理的条件下，定量分析G6PC和GLUT4转录表达的情况，因此在传有HepG2细胞的6孔盘里加入2 mmol·L-1的H2O2分别处理不同时间(0 h、1h、2 h、4 h)，提取RNA进行qRT-PCR检测，如图1A 所示，G6PC和GLUT4的mRNA相对表达量随时间梯度显著增高，但GLUT4的表达量在持续4 h H2O2处理后逐渐恢复；以及加入不同浓度(0 mmol·L-1、1 mmol·L-1、2 mmol·L-1、4 mmol·L-1)的H2O2分别处理2 h，提取RNA进行qRT-PCR检测，如图1B所示，G6PC和GLUT4的mRNA相对表达量随浓度梯度而增加。以上结果证明，糖异生关键基因G6PC和GLUT4转录表达是依赖于细胞内的氧化应激水平。

2.2H2O2作用HepG2肝癌细胞后G6PC和GLUT4蛋白水平的变化在H2O2处理的条件下，定量分析G6PC和GLUT4蛋白表达的情况，因此在传有HepG2细胞的6孔盘里加入不同浓度(0 mmol·L-1、2 mmol·L-1、4 mmol·L-1)的H2O2分别处理2 h，提取样本进行Western蛋白印迹检测，如图2A所示，G6PC和GLUT4的蛋白相对表达随浓度梯度显著降低；以及加入2 mmol·L-1的H2O2处理不同时间(0 h、2 h、4 h)，提取样本进行Western蛋白印迹检测，实验结果如图2B所示，G6PC和GLUT4的蛋白相对表达随时间梯度显著降低。实验证明，细胞内氧化应激会诱导G6PC和GLUT4蛋白水平的降低。为了验证在氧化应激条件下，HepG2肝癌细胞的G6PC和GLUT4蛋白表达会受到影响，因此用免疫荧光实验观察G6PC和GLUT4在细胞内的定位情况及蛋白表达情况。细胞贴于盖玻片后给予含H2O2的培养基1 mL，使H2O2终浓度为2 mmol·L-1，处理时间为2 h。如图3所示，H2O2处理后G6PC和GLUT4整体荧光亮度较对照组减弱，但核内荧光亮度较对照组稍强。综上，通过Western Blot和免疫荧光实验我们都证明细胞内氧化应激确实能诱导G6PC和GLUT4蛋白水平的降低。

2.3H2O2对糖异生关键转录因子FOXO1蛋白在细胞内定位表达的影响为了验证氧化应激对G6PC和GLUT4基因表达是通过影响其上游转录因子的表达而进行调控，因此用免疫荧光实验观察FOXO1在细胞内的定位情况。细胞贴于盖玻片后给予含H2O2的培养基1 mL，使H2O2终浓度为2 mmol·L-1，处理时间为2 h。如图4所示，H2O2处理后FOXO1胞质荧光亮度较对照组增强，核内荧光亮度较对照组减弱。实验证明，氧化应激确实会诱导FOXO1从细胞质进入细胞核内。这一定位的改变会导致其调控功能的转换。

(A)qRT-PCR检测用2 mmol·L-1 H2O2处理不同时间梯度的G6PC和GLUT4基因的mRNA相对表达量；

(A)Western Blot检测用不同浓度梯度的H2O2处理2 h后G6PC和GLUT4的蛋白表达；

(A)使用G6PC抗体对用或不用H2O2处理的HepG2肝癌细胞进行免疫荧光染色，细胞核用DAPI染色；

使用FOXO1抗体对用或不用H2O2处理的HepG2肝癌细胞

3 讨 论

长期以来，有大量研究揭示了肝癌细胞与氧化应激之间的关系,比如辣椒素能剂量依赖性诱导HepG2 肝癌细胞的凋亡，其机制与氧化应激水平过激活相关[16]；雷公藤甲素刺激了肝癌细胞内氧化应激的发生，从而使细胞发生凋亡[17]。但目前氧化应激对肝癌细胞糖代谢方面的研究知之甚少，因此，为了研究氧化应激在肝癌细胞中调控糖异生的作用机制，我们设计H2O2来模拟氧化应激环境，检测HepG2 肝癌细胞中的糖异生关键基因的表达情况，我们的结果显示，G6PC和GLUT4的转录表达增高，而蛋白表达降低；以及FOXO1蛋白含量在胞质里明显增高。这些实验结果表明了氧化应激能促进肝癌细胞FOXO1蛋白的表达，从而上调G6PC和GLUT4基因的转录，进一步证实了氧化应激能促进糖异生的发生。但由于在氧化应激条件下，细胞内的蛋白质可能通过构象改变而受到破坏或降解[18]，因此在我们的实验中，G6PC和GLUT4的蛋白表达是降低的，这与它们的转录表达增高并不矛盾。

已有研究表明FOXO1可以通过激活多种基因的表达来促进糖异生，它的活性与其翻译后修饰紧密相关，其中包括磷酸化、泛素化和乙酰化[19]。FOXO1蛋白分布在细胞核和细胞质组分中，细胞核中的非磷酸化FOXO1蛋白可以激活各种糖异生基因的转录，当FOXO1磷酸化后，它从细胞核移位至细胞质，从而导致其转录活性丧失[20]。有体外实验表明，氧化应激增强了FOXO1蛋白的表达，并抑制FOXO1蛋白磷酸化，随后增强了PEPCK的表达[21]。PEPCK是糖异生调节的关键酶以及FOXO1的下游效应因子，降糖药物可以通过抑制FOXO1来降低PEPCK的表达，从而实现线粒体功能的增强以及控制肝脏中的血糖保持在稳定水平[22]。另有研究表明，氧化应激增强了FOXO1在多核巨细胞中的转录活性，增强了FOXO1在胞质中的表达[23]。在我们的细胞实验中，氧化应激导致部分FOXO1蛋白定位从细胞质转移到细胞核内，从而增强了糖异生G6PC和GLUT4基因的转录，这与他们的实验结果相似。

FOXO1还参与2型糖尿病(T2DM)患者的胰岛素抵抗和细胞因子介导的β细胞衰竭，并导致糖异生、细胞凋亡、不受控制的自噬以及细胞周期停滞[24]。此外，有研究发现抗糖尿病药物和AM251可以通过抑制FOXO1来下调PEPCK和G6PC的表达，从而控制肝脏中的血糖保持在稳定水平[25]。与此相似的是，我们的研究发现氧化应激可以促进肿瘤细胞的FOXO1表达增高，从而上调G6PC和GLUT4的表达，于是可以推测某些抗氧化应激药物可能会抑制肿瘤细胞糖异生的发生，这可能为治疗伴有2型糖尿病的肿瘤患者提供了一种重要理论依据。但由于体外实验不能完全模拟体内实验的氧化应激环境，我们的实验结果受到一定程度的限制，未来我们将构建小鼠模型来展开进一步的研究。