龙血竭胶囊对SD大鼠放射性皮肤损伤防护作用及机制的初步研究

许明君，郭海亮，袁 军，王金凤，邓永双，罗彬彬，李玉磊

(1.赣南医学院第一附属医院，江西 赣州 341000；2.崇义县人民医院，江西 崇义 341300；3.南昌大学第一附属医院，江西 南昌 330000)

放射性皮肤损伤是接受放射治疗患者常见不良反应，轻则皮肤色素沉着，干性脱皮；严重则出现湿性脱皮、溃疡出血，晚期皮肤变薄、纤维化[1]。放射性皮炎一旦发生，治疗需要较长时间，严重的难以愈合，甚至带来不可逆的功能障碍。放射性皮肤损伤的原理是皮肤受到照射后产生大量自由基，皮肤细胞的DNA或细胞膜受到损伤将导致皮肤细胞凋亡。目前临床上使用较多的是比亚芬药膏，主要成分是三乙醇胺，具有良好的水合作用，通过减轻皮肤干燥、清洁、加快渗出物排出、改善微循环、减轻炎症反应、促进胶原合成起作用[2-5]。但比亚芬药膏只是作为放射性皮炎的预防用药，一旦皮肤出现湿性脱皮将不再适合使用。龙血竭为百合科龙血树属植物剑叶龙血树提取的树脂，其化学成分以酚类化合物为特征，具有抗脂质过氧化、清除自由基、收敛、紫外吸收、抗虫、抑菌和保水等多种生物活性[6-7]。本研究选择大鼠模型，研究龙血竭对大鼠是否具有皮肤放射性损伤防护作用，初步探讨其防护机制，为龙血竭用于防护放射性皮肤损伤提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1药品、试剂及仪器龙血竭胶囊(云南云河药业股份有限公司)。比亚芬(BIAFING)乳膏(法国梅迪克斯制药厂)，BCA蛋白定量试剂盒(江苏省海门市碧云天生物公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、总谷胱甘肽(GSH)超微量三磷酸腺苷(ATP)酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，Bcl-2抗体、Bax抗体和活化Caspase-3抗体(美国Santa Cruz公司)。放射治疗机器(美国瓦里安公司)，免疫印迹设备(美国Bio-Rad公司)。

1.2动物分组及照射条件由湖南斯莱克景达实验动物有限公司购入健康雄性SD大鼠100只，合格证号SCXK(湘)2016-0002，SPF级，体重(197.15±10.18) g，饲养于湿度为45%赣南医学院动物中心大鼠垫料窝内，常规颗粒饲料饲养，许可证号 SYXK(赣) 2012-0006。将大鼠随机分为5组：空白对照组(Ctrl)、龙血竭对照组(LC)、照射模型组(RT)、比亚芬治疗组(RT+BIA)、龙血竭治疗组(RT+LC)，每组20只。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(每100 g注射10%水合氯醛0.3 mL)。大鼠背部照射区域剃毛后，用龙胆紫画好4 cm×4 cm照射野。根据文献选择30 Gy β射线进行皮肤放射性损伤模型制备[4]。龙血竭治疗组、比亚芬治疗组、照射模型组用Varian23 EX直线加速器产生的照射量率为400 cGy·min-1的 6 MeV β射线照射大鼠背部皮肤，照射面积为4 cm×4 cm，非照射部位以铅板屏蔽；照射总剂量均为30 Gy。龙血竭正常对照和正常空白对照组不予照射。龙血竭治疗组大鼠照射后立即予以龙血竭胶囊粉末外敷(6.5 mg·cm-2)，比亚芬治疗组大鼠照射后立即予比亚芬(10 mg·cm-2)外涂照射野皮肤，龙血竭对照组予以龙血竭胶囊粉末外敷(6.5 mg·cm-2)，每日2次至照射后2周，照射模型组和空白对照组对皮肤不加干预。

1.3拍照记录大鼠皮肤外观各组大鼠于照射损伤后1周及2周拍照，记录皮肤外观。

1.4HE染色光镜观察皮肤组织结构照射后3天取全层皮肤组织标本，石蜡切片，苏木精—伊红染色，光镜下观察皮肤组织病理形态。

1.5SOD活性、GSH、MDA、ATP酶含量测定将照射后3天大鼠皮肤组织制成组织匀浆，腹主动脉采血，静置10 min，4 ℃(离心半径8 cm，4 000 r·min-1，10 min)离心，收集血清，于-80℃保存。严格按照试剂盒说明书操作，检测MDA含量，GSH-Px、SOD、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。多功能酶标仪测定吸光度(A)值。BCA方法检测组织匀浆蛋白含量。按试剂盒公式分别计算酶的活性和MDA含量，其中组织中的酶的活性与MDA含量以每mg蛋白中相应的活性或含量为单位。

1.6Westernblot方法检测凋亡相关蛋白的表达皮肤组织剪碎后置于加入了PMSF 的RIPA裂解液中，制成组织匀浆，4 ℃、10 000×g离心10 min取上清液，BCA蛋白定量试剂盒测定上清液蛋白浓度。取50 μg蛋白，加入上样缓冲液，置于98 ℃水浴5 min，冰上放置5 min，-80 ℃存放。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，电转至硝酸纤维膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h后，Bcl-2、Bax、Caspase-3及β-actin一抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜，加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，37 ℃孵育2 h。ECL显影液显色，凝胶成像仪拍照分析。

2 结 果

2.1照射后皮肤外观照射后第1周：各照射组皮肤滤泡样暗红斑、肿、触痛。对照组大鼠剃毛区域长出新毛，外观恢复如常。照射后第2周：龙血竭治疗组照射野皮肤干性脱皮，比亚芬治疗组除干性脱皮外出现小片状湿性脱皮，照射模型组照射野内湿性脱皮和溃疡(见图1)。

2.2HE染色观察照射野皮肤组织病理图2为大鼠皮肤HE染色病理切片，从图中可以看出龙血竭对照组和空白对照组表皮、真皮、皮下组织结构完整，毛囊和附属腺体细胞分布正常。照射模型组病理改变最明显，表皮细胞层数显著减少，真皮层见少量毛囊结构，腺体明显萎缩，龙血竭治疗组和比亚芬治疗组表皮细胞层数比对照组少，比照射模型组多，真皮层可见细胞水肿变性，毛囊结构减少，皮脂腺和汗腺萎缩，皮下组织萎缩，但都比照射模型组程度更轻。

图1 30 Gyβ射线对各组大鼠皮肤辐射损伤的观察

1.空白对照组;2.龙血竭对照组;3.照射模型组;4.比亚芬治疗组;5龙血竭治疗组。

2.3龙血竭对ATP酶的影响图3为龙血竭对皮肤组织Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶影响的统计箱图，从图中可以看出龙血竭对Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶没有明显影响，组间统计没有差异(P>0.05)。

Ctrl：空白对照组;LC：龙血竭对照组;RT:照射模型组;RT+BIA:比亚芬治疗组;RT+LC：龙血竭治疗组，下图同。

2.4龙血竭抗氧化作用结果如图4所示。龙血竭对照组与空白对照组比较，血清及皮肤组织GSH-Px活性均升高，说明龙血竭对正常组织具有提高抗氧化作用，但其对SOD和MDA无影响。照射模型组与空白对照组比较，血清和皮肤组织GSH-Px和SOD活性均降低，而MDA含量升高，提示照射后可抑制机体和皮肤的抗氧化能力，产生氧化应激损伤。与照射模型组相比，龙血竭和比亚芬治疗组血清GSH-Px活性升高，但对血清SOD和MDA无影响；皮肤组织GSH-Px和SOD活性均升高，同时MDA含量降低，说明两种药物均可通过提高抗氧化酶的活性，抑制氧化应激起保护作用。照射后两种药物治疗组比较，龙血竭治疗组的血清GSH-Px、组织GSH-Px和SOD活性高于比亚芬组，提示在抗氧化能力方面，龙血竭优于比亚芬。

注：**P<0.01，***P<0.001与正常对照组相比;#P<0.05，###P<0.001与模型组相比;

2.5龙血竭对大鼠皮肤组织Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响结果如图5所示。龙血竭对照组与空白对照组比较，Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达没有明显差异。照射模型组与空白对照组比较，Bcl-2蛋白表达降低，Bax、Caspase-3蛋白表达升高，提示照射后抑制细胞凋亡的蛋白表达降低，引起细胞凋亡。与照射模型组相比，龙血竭和比亚芬治疗组，Bcl-2蛋白表达相对较高，Bax、Caspase-3蛋白表达相对较低，说明两种药物均可通过提高抑制细胞凋亡蛋白表达起保护作用。照射后两种药物治疗组比较，龙血竭治疗组的Bcl-2蛋白表达高于比亚芬组，而Bax、Caspase-3蛋白表达降低，提示在抗细胞凋亡方面，龙血竭优于比亚芬。

图5 龙血竭对大鼠皮肤组织Bcl-2，Bax，Caspase-3表达的影响

3 讨 论

“龙血竭”为百合科龙血树属植物剑叶龙血树提取的树脂，具有活血散瘀，定痛止血，敛疮生肌的功效，其化学成分以酚类化合物为特征，具有抗脂质过氧化、清除自由基、收敛、紫外吸收、抗虫、抑菌和保水等多种生物活性。近年来，有研究表明龙血竭具有明显的体外和体内抗氧化活性，动物实验发现龙血竭对小鼠的肝、脾、脑组织和骨髓细胞均有放射性损伤防护作用[8]。

本实验中，通过对各组照射后皮肤反应的观察，发现龙血竭可以减轻照射导致的皮肤损伤，其效果略好于比亚芬；从病理切片的结果可以看出龙血竭治疗组与照射模型组比较，皮肤各层细胞结构都得到保护，说明龙血竭胶囊对SD大鼠放射性皮肤损伤有防护作用。龙血竭对照组皮肤组织病理与空白对照组无差别，说明龙血竭对正常皮肤无影响。

Na+-K+-ATP酶在维持膜通透性、膜内外离子成分及维持细胞正常代谢等方面起重要作用；Ca2+-Mg2+-ATP酶也是广泛存在于细胞膜上的重要的膜结合酶，膜活性的降低可引起细胞的离子膜转运障碍及胞浆内钙离子的积聚，导致细胞的形态、结构和功能的异常[9]；本实验中检测了各组大鼠皮肤样本中各ATP酶含量差异无统计学意义(P>0.05)，这说明龙血竭并不能影响Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性。

皮肤在受到大剂量的电离辐射作用时会产生大量不稳定的具有很高氧化活性的自由基，自由基可以破坏细胞膜结构从而导致放射性皮肤损伤[10]；哺乳动物本身具有一系列抗氧化抵御自由基损伤的功能，参与抗氧化的酶主要是SOD和GSH-PX。SOD清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤，GSH-PX特异地催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。当皮肤细胞的细胞膜受损将释放MDA。检测MDA的含量可间接测定膜系统受损程度。本实验受照射的大鼠皮肤组织和血清GSH-Px和SOD活性降低，MDA升高，说明射线照射后皮肤细胞和血清中抗氧化酶降低，细胞膜的脂过氧化程度升高，皮肤细胞受到不同程度的损伤；龙血竭治疗组皮肤组织中的GSH-Px和SOD活性明显升高，且高于比亚芬治疗组，MDA降低，说明龙血竭可以保护机体的抗氧化酶，从而减少自由基过氧化反应对皮肤细胞的损伤，与文献报道一致[3,11]。

皮肤早期反应主要是表皮细胞受损，随照射剂量的增高，真皮细胞可能发生延迟反应，皮肤变薄、变脆，还可见到血管扩张，这说明血管结构受到损伤。有文献报道龙血竭治疗放射性湿性脱皮和溃疡伤口愈合有确切效果[12-16]。本实验龙血竭治疗组血清中的GSH-Px含量相对单纯照射和比亚芬治疗组升高，说明龙血竭还可以保护血液中的GSH-Px，进而提高血管内皮细胞抗氧化能力，这对预防和治疗皮肤晚期损伤有重要意义。

射线作用的关键靶点是细胞内的DNA[17]，自由基可能通过损伤DNA、影响信号传导以及参与基因表达调控等途径介导细胞凋亡从而导致放射性皮肤损伤。Xin N等[18]报道，龙血竭对大鼠放射性脑损伤有防护作用，其机制与它抑制凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达相关。Bcl-2作为一种调亡抑制基因蛋白产物，可通过抗氧化作用和抑制氧自由基起到抑制细胞凋亡的作用[19]，有学者研究发现[20]，龙血竭粉外敷在糖尿病模型大鼠烫伤皮肤组织愈合过程中对Bcl-2有调节作用，龙血竭能明显促进Bcl-2蛋白表达，抑制细胞凋亡，改善创面微循环。本实验Western blot检测结果也显示龙血竭组Bcl-2蛋白表达升高，Bax、Caspase-3蛋白表达降低。

综上所述，龙血竭对放射性皮肤损伤有防护作用，其机制可能为保护机体的抗氧化酶和抑制细胞凋亡。