鲑鱼降钙素对小鼠MC3T3-E1细胞BMP-2蛋白表达的影响

宋 梅

（武警内蒙古总队医院风湿免疫科，内蒙古 呼和浩特 010010）

骨质疏松症是一种骨量减少、骨组织纤维结构破坏为特征，导致骨脆性增加，从而易发生骨折的代谢性骨病。临床主要表现骨骼疼痛和骨密度降低，骨折危险性明显增加，严重影响骨质疏松患者的生活质量。形成骨质疏松的原因与破骨细胞功能亢进，成骨细胞作用相对不足有关。降钙素是一种强有力的作用破骨细胞的抑制剂，可快速、广泛抑制骨吸收[1]，因而临床上常被用于治疗高钙血症、原发性甲旁亢和重度骨质疏松症等。近年来，降钙素作为抗骨质吸收药，应用在骨质疏松症的临床治疗中，取得了一定的临床疗效。短期应用具有良好的缓解骨痛作用，并显著降低骨转换率。一些体外实验和体内实验提示，其在抑制骨破坏的同时[2-3]，也可以促进成骨细胞的形成、骨骼发育和再生修复，从而改善骨代谢[4]。骨形成发生蛋白（BMP-2）是有效的成骨细胞分化诱导因子，能够促进成骨细胞分化、诱导体外成骨的能力，同时可以使成骨细胞的前体细胞定向分化为成骨细胞[5-6]。因此，BMP-2在成骨细胞的增殖分化中发挥重要作用。但是，鲑鱼降钙素促进成骨细胞的形成与再生修复是否与BMP-2有关，国内外至今尚少见研究。本研究采用分子生物学手段从蛋白水平，研究不同剂量的鲑鱼降钙素对小鼠MC3T3-E1细胞BMP-2蛋白表达水平的影响，从而为鲑鱼降钙素对骨代谢提供重要理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般材料：小鼠MC3T3-E1成骨细胞系，是由协和医科大学基础研究所提供。鲑鱼降钙素试剂购自瑞士诺华制药公司。兔抗鼠BMP-2多克隆抗体，北京鼎国生物技术中心。兔抗鼠GAPDH多克隆抗体，北京鼎国生物技术中心。HRP-羊抗兔IgG，博士德生物技术中心。蛋白Marker，美国Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞鉴定：取生长良好、80%融合的小鼠MC3T3-E1细胞爬片，通过HE染色、碱性磷酸酶（ALP）染色（Kaplow氏法），监测成骨细胞性质。

1.2.2 实验分组：取生长满培养瓶壁的小鼠MC3T3-E1细胞，用PBS洗涤2遍，再用0.25%胰蛋白酶消化5 min，按1×105/mL密度的细胞悬液接种于培养瓶内；保证各组瓶中的培养液均为2 mL，放置在CO2培养箱中培养24 h后。随机分为对照组、低剂量组鲑鱼降钙素2.5 ng/mL、中剂量组：鲑鱼降钙素5 ng/mL、高剂量组：鲑鱼降钙素10 ng/mL，每组各设8瓶，按照不同浓度鲑鱼降钙素量，加入培养液中，放置于CO2培养箱中培养24 h。

1.2.3 细胞提取：继续培养24 h后，各组收集培养瓶细胞，PBS洗涤2次，0.25%胰蛋白酶消化5 min，4 ℃ 400×g离心10 min，弃上清。每个EP管中加入100 μL细胞裂解液用于提取细胞总蛋白，在冰浴中裂解15 min，4 ℃ 20000×g离心15 min，取出上清，用于测定蛋白含量。总蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法。

1.2.4 蛋白质印迹：制备样品并进行SDS-PAGE电泳，蛋白充分变性后，各组取30 μg样品，恒压80 V（电流为20～40 mA），1 h后调至150 V，电泳2.5 h至溴酚蓝距离凝胶底部1 cm时，停止电泳。4 ℃条件下恒压（100 V）电转膜2.5 h。封闭PVDF膜，室温振荡1 h。分别加入TBS配制的BMP-2和GAPDH兔抗小鼠单克隆抗体（1∶100稀释），4 ℃孵育过夜，TBS洗膜3次，在转移脱色摇床上平缓摇动，每次10 min。将PVDF膜控干水分，放进杂交袋，分别加TBS配制的HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（1∶100稀释），37 ℃孵育1 h，用TBS漂洗膜3次，每次10 min，平缓摇动。将NC膜平铺在保鲜膜上，采用化学发光法显色1 min，在暗盒中曝光1 min，显影，定影。

1.2.5 图像分析：以上方法得到的凝胶，用ImageJ凝胶分析软件对已经显影条带进行半定量分析，AU（Darea·Ddensity）代表条带的面积、灰度值，BMP2/GAPDH的AU比值表示蛋白相对含量。

1.2.6 统计学处理：用SPSS 16.5的统计软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，各组均数比较行单因素方差分析（ANOVA），用最小显著差异法（LSD）作两两比较，P＜0.05有显著性差异。

2 结 果

蛋白质印迹显示，各浓度鲑鱼降钙素与对照组相比，BMP-2活性明显高于对照组，其中低剂量组（0.5620±0.020）与对照组（0.5386±0.028），中剂量组（0.6228±0.012）与对照组（0.5386±0.028）相比蛋白含量有增高，但无统计学意义。高剂量（0.7813±0.010）与对照组（0.5386±0.028）相比蛋白含量明显增高，且有统计学意义（P＜0.01），见图1、表1。

表1 小鼠MC3T3-E1成骨细胞BMP-2蛋白相对含量分析表

3 讨 论

在研究治疗骨质疏松的过程中，降钙素具有明显抑制骨吸收，显著减少骨折发生率，增加腰椎骨密度的作用。自1985年美国食品药物管理局批准用于治疗骨质疏松以来，现临床广泛运用并取得满意疗效。一定剂量的降钙素能改变破骨细胞形态。通过与破骨细胞表面的降钙素受体结体后抑制破骨细胞功能。也有研究报道，降钙素能增加成骨细胞活性，从而起到改善骨质，纠正骨质疏松。但何种剂量的降钙素可以影响成骨细胞的增殖，及通过何种转移因子影响成骨细胞的表达活性，目前不得而知。

BMP-2具有诱导成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力。正常骨基质中含有少量的BMP-2，主要存在于成骨细胞、骨细胞膜和骨髓细胞中，并通过自分泌或旁分泌形式诱导成骨细胞分化，形成新的成骨[7]。将重组rhBMP-2植入到大鼠肌肉组织中，可以促进异位骨形成。离体BMP-2可诱导成骨细胞前体细胞分化为较成熟的成骨样细胞，并抑制肌原细胞的分化。Fromigue等[8]研究中发现rhBMP-2可在mRNA水平，增强碱性磷酸酶活性、骨钙素和细胞外间质的钙储备。另有研究[9]，在人的新生成骨细胞前颅盖骨细胞中，加入rhBMP-2（50 μg/L），培养3～7 d，可以影响不成熟的颅盖骨细胞，加速细胞生长，增强碱性磷酸酶活性。2～3周时，基质矿化明显增加，在第3周时骨钙素mRNA和蛋白表达增强，钙在基质中的含量明显增加，提示成骨细胞完全分化。由此认为，BMP-2含量的多少直接影响着成骨细胞的分化，决定着骨重建的结局。

本研究采用小鼠MC3T3-E1细胞，根据临床常用鲑鱼降钙素浓度，配制低、中、高浓度组鲑鱼钙素，加药24 h，通过Western-blot技术，观察BMP-2的蛋白表达水平变化。研究发现，低中剂量组鲑鱼降钙素与对照组相比，表达呈逐渐上升趋势，但无统计学意义。高剂量组与对照组相比，蛋白表达水平最高，有统计学意义 （P＜0.01）。表现出明显的剂量刺激关系。本试验说明鲑鱼降钙素可以通过刺激BMP-2蛋白表现，促进成骨细胞增殖，降钙素与BMP-2通过多种作用机制相互配合，协同促进骨形成和重建，从而改善骨基质，这为骨质疏松的临床治疗提供了新的理论依据。