臭氧水对土柱土壤生物化学性状的影响

魏俊杰， 洪坚平

(山西农业大学， 山西 晋中 030801)

土壤中存在一部分不利于作物生长，使作物发病受害的微生物，人们将由这类土传病原微生物引起的作物病害统称为土传病害[1]。由于土传病害造成的作物减产达20%～30%，严重的地区达50%以上，甚至绝收[2]，故消除土传病害并维持土壤健康可持续利用已成为农业发展亟待解决的难题之一。

目前，国内外采取消除土传病虫害的措施主要有高温闷棚、培育抗病性强的作物品种、采用生物熏蒸技术和强氧化还原法等[3-5]，以上方法在治理土传病害方面均已取得成效，但每种方法有其适用性但也有局限性。

臭氧是氧气的同素异形体[6]，是一种强氧化剂，最早应用于仓储害虫的防治[7-8]，其具有高效的杀菌作用，且对微生物的杀菌作用也高效快速[9-11]。研究表明，臭氧可以迅速杀灭微生物，然后分解产生氧气，既无毒无害又不产生任何污染与残留，因此被视为理想的绿色强氧化剂[12]。

目前，国内外对臭氧水的研究愈发增多，且已开始将臭氧应用于农业生产中。已有研究表明，浇灌臭氧水对韭菜地下害虫韭菜迟眼蕈蚊有显著防治效果[13-16]。田苗等[17]指出，在室温条件下，臭氧水浓度为0.43 mg/L时，可将植物中的大肠杆菌全部杀死。STRICKLAND等[18]用臭氧水处理水果沙拉后发现，产品保质期得到明显延长，从而降低了损耗成本。WEI等[19]在对木瓜进行臭氧处理后，得到臭氧处理能明显降低木瓜营养价值流失的结论。目前关于臭氧水对土壤影响的研究较少，吴启佳等[20]发现臭氧水对土壤有机质、总氮和速效养分含量有着显著的降低作用。荆世杰等[21]研究臭氧对温室土壤0～15 cm土壤理化性质的影响中指出，臭氧水处理后的土壤有机质、铵态氮含量显著下降。由于臭氧的强氧化性，其对土壤的主要成分理化性质的影响还鲜有报道[22]。为此，笔者等以臭氧水处理后的试验柱土壤为研究对象，探究臭氧水处理土壤不同深度和不同时间的农田土壤微生物量以及养分含量的变化，以期为治理土传病害提供科学依据。

1 材料及方法

1.1 供试材料

供试臭氧水：室温下，将臭氧气体快速溶于蒸馏水中制取浓度为28 mg/L 的臭氧水，臭氧气体由山西中通高技术科技有限责任公司利用OZU-AP-300型臭氧机组制取。

供试土壤：太谷农田土，取自山西农业大学资源环境学院试验站(东经112.6°，北纬37.4°)，属黄土状石灰性褐土，质地为轻壤，新鲜土壤初始含水量为9%。

仪器：蒸汽灭菌器(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)，光照培养箱(杭州惠尔仪器股份有限公司)、水浴恒温振荡器：SHZ-88型、火焰光度计：FP6400A型、订制土柱

1.2 试验设计

在山西农业大学资源环境学院试验的试验地中，用自制土柱取样器(图1)取原状土40 cm，然后立即密封底部及小孔。根据预试验的简易模拟，试验所用浓度为28 mg/L的臭氧水300 mL能使半径1.7 cm、高40 cm的的土柱饱和，因此在土柱中注入臭氧水2 L，在30 cm处达到均匀性饱和。以浇灌2 L蒸馏水的自制土柱为对照 ，土柱灌水后立即将土柱密封。

1.2.1 不同处理时间的土壤微生物量和养分含量考察 在微生物量的考察上，试验设置6个处理，分别为臭氧水处理1 h、3 h、5 h、7 h、9 h和11 h；在养分含量的考察上设置4个处理，分别为臭氧水处理1 h、5 h、10 h和24 h，各处理3次重复，取平均值。在臭氧水处理后，按照试验处理的时间，用消毒杀菌后的不锈钢取土器从土柱深度10 cm、20 cm、30 cm处采集2 g土样，然后将所采土样混合并分为2份，

图1 自制取样土柱

1份微生物培养并测定土壤微生物量及灭火率，1份放入—4℃冰箱冷冻保存24 h后取出，风干测定含水量，然后过20目筛测定土壤速效磷、速效钾，最后过100目筛测定土壤有机质。

1.2.2 不同深度土壤微生物量和养分含量考察 不同深度土壤共设3个处理，分别为10 cm、20 cm和30 cm，每个处理3次重复，取平均值。在臭氧水处理24 h后，用消毒杀菌后的不锈钢取土器插入10 cm、20 cm、30 cm层土壤的对应小孔采集土样，每层随机采集5个样品，将所采土样分为2份，1份土样进行微生物培养并测定土壤微生物量及灭火率，1份混合土样放入—4℃冰箱冷冻保存24 h后取出，风干测定含水量，然后过20目筛测定土壤速效磷、速效钾，最后过100目筛测定土壤有机质。

1.3 考察指标的测定

土壤微生物数量测定采用稀释平板计数法对细菌、真菌、放线菌进行计数，以对照土样菌落数为基数计算灭活率。土壤中硝态氮采用酚二磺酸比色法[23]，碱解氮采用碱解扩散法[23]，铵态氮采用KCl浸提，靛酚蓝比色法[23-24]进行测定。土壤有机质采用重铬酸钾容量法—外加热法进行测定，土壤速效磷采用0.5 mol/L NaHCO3浸提法提取，钼锑抗比色法[23]进行测定，土壤速效钾采用1 mol/L NH4OAC浸提法提取，火焰光度法[23]进行测定。

1.4 数据分析

应用Excel 软件，计算各处理的平均值及标准偏差，并绘图。通过Spss 软件，运用LSD 法进行(P<0.05)多重比较显著性分析。

2 结果与分析

2.1 臭氧水处理不同时间对柱状土壤微生物及养分含量的影响

2.1.1 土壤微生物量 从表1可知，臭氧水处理不同时间土柱中细菌、真菌和放线菌的菌落数变化及灭活率。

1) 细菌。臭氧水处理土壤后，土壤中细菌菌落数量显著降低，臭氧水处理1 h的细菌灭活率最高，为93.28%，且在其余处理时间内,其灭活率均在80%以上，说明臭氧水在一定时间内能显著减少土壤中的细菌数量。臭氧水处理后细菌菌落数量表现为先升高后下降再升高的趋势，这可能与取样时间长短以及不规范操作有关，导致细菌繁殖规律出现一定偏差。

表1臭氧水不同处理时间土柱土壤中的微生物菌落数及灭活率

Table 1 Colony count and inactivation ratio of microorganism in soil samples treated with ozone water under different treatment time

处理时间/hTreatment time菌落数/(105CFU/g) Colony count细菌真菌放线菌灭活率/% Inactivation ratio细菌真菌放线菌0(处理前)804±81 a184±28 a215±24 a000 154±16 e16±8 d44±10 d93.2891.3079.64376±25 d18±4 d55±15 c90.5590.2274.235157±49 b18±8 d 58±7 c80.4790.2273.207115±32 c28±12 c61±17 c85.7084.7871.62989±31 d 30±16 c80±10 b88.9383.7062.7411101±48 d42±21 b81±15 b87.4377.1762.37

注：表中同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significance of difference atP<0.05 level. The same below.

2) 真菌。臭氧水处理土壤后，土壤中真菌菌落数量显著降低，真菌的灭活率在臭氧水处理1 h时为91.30%,且在其余处理时间内维持在77%以上，说明臭氧水能显著减少土壤中的真菌数。此外，真菌菌落数随着时间的延长而缓慢增加，这是由于臭氧水半衰期较短，约为20 min，在其有效范围内可能不能完全杀死真菌，臭氧水分解后，土壤中残存的真菌进行繁殖，导致数目增多。

3) 放线菌。臭氧水处理土壤后，土壤中放线菌菌落数量显著降低，放线菌的灭活率在臭氧水处理1 h时为79%,在其余处理时间维持在62%以上，说明臭氧水能显著减少土壤中的放线菌数。放线菌的变化趋势和真菌类似，其在臭氧水处理后1 h的灭活率达到最高，随后逐渐降低，降低的原因可能是由于臭氧水分解后残存的放线菌继续繁殖。另外，放线菌灭活率远低于细菌和真菌的杀菌效果，其原因可能是放线菌依靠孢子繁殖，孢子外有一层厚厚的孢子壁，能一定程度上抵挡臭氧水的强氧化，致使有相当一部分放线菌经臭氧水处理后存活。

2.1.2 土壤养分含量 从图2可知，臭氧水处理不同时间土柱土壤中速效磷、速效钾和有机质含量的变化。

1) 速效磷及速效钾含量。臭氧水处理后1 h，速效磷含量上升幅度达9.4%，但与对照(蒸馏水)不显著。此后，均呈下降趋势，在1～5 h内速效磷含量显著下降，此时含量低于初始值，5～10 h小幅回升，之后10～24 h内趋于平缓。整体而言，1～24 h 内速效磷含量与对照差异不显著。1 h内速效钾上升幅度约3.6%， 1～5 h内增加10.1%，与对照差异显著，5～10 h内速效钾含量下降约7.6%，但与对照差异不显著，此后10～24 h内无变化，但与对照相比，有5.6%的提升。总而言之，臭氧水处理后的速效钾含量均高于对照，但仅5 h时与对照差异显著。

2) 有机质含量土壤有机质是土壤的重要组成部分，其含量是衡量土壤肥力的重要指标。经臭氧水处理的有机质含量与对照(蒸馏水)相比在1 h、5 h、10 h、24h显著降低35.8%、41.6%、41.0%、42.8%。

图2 臭氧不同处理时间土柱土壤的养分含量变化

2.2 臭氧水处理对不同深度土柱土壤微生物量及养分含量的影响

2.2.1 土壤微生物量 从表2可知，臭氧水处理24 h后不同深度土柱土壤细菌、真菌和放线菌的菌落数和灭活率。

1) 细菌菌落。臭氧水处理后，10 cm深度土壤的细菌菌落数量显著下降，在20 cm及30 cm深度的细菌菌落数量下降不显著。细菌在10 cm深度土壤的灭活率为33.27%，其后随着深度的加深，灭活效果随之降低，说明臭氧水对10 cm内的土壤灭活效果最好。

2) 真菌菌落。臭氧水处理后，10 cm深度土壤的真菌菌落数量显著下降，在20 cm及30 cm深度真菌菌落数量下降不显著。真菌在10 cm深度土壤灭活率为39.62%，其后随着深度加深，灭活效果随之降低，说明臭氧水对真菌的最佳施用范围是深度10 cm内的土壤。

3) 放线菌菌落。臭氧水处理后，放线菌的菌落变化与细菌、真菌的菌落变化一致，在土深10 cm处灭活率最高，为28%。放线菌灭活率小于细菌、真菌，其原因可是放线菌依靠孢子繁殖，孢子外有一层厚厚的孢子壁，能一定程度上抵挡臭氧水的强氧化，致使有相当一部分放线菌经臭氧水处理后存活。

表2臭氧水处理前后不同深度土柱土壤中的微生物菌落数及灭活率

Table 2 Colony count and inactivation ratio of microorganism in soil samples with different soil depth before and after ozone water treatment

处理Treatment土层深度/cmSoil depth菌落数/(105CFU/g) Colony count细菌真菌放线菌平均灭活率/% Average inactivation ratio细菌真菌放线菌空白组CK102 026±206 a265±37 a430±46 a 201 586±158 c231±26 b319±55 b 302 037±228 b238±34 c338±26 d试验组 Test group101 352±150 d160±25 d310±32 c33.2739.6227.91 201 421±89 c210±37 b270±29 e10.4010.0015.36 301 967±130 b225±40 c319±32 d3.435.465.62

2.2.2 土壤养分含量 从图3可知臭氧水处理前后，不同深度土柱土壤中的养分含量变化。

1) 速效磷。臭氧水处理后速效磷含量降低，在土壤深度10 cm和20 cm的速效磷分别较对照降低39.1%和17.4%，在30 cm土层中，速效磷含量无变化，土壤深度20 cm和30 cm的速效磷含量与对照差异不显著。10 cm土壤中速效磷含量降低幅度比20 cm高，是因为表层土壤中有机物质含量高，大量的有机阴离子使其在争夺固相表面的专属位点时占具优势，而臭氧水氧化有机质，使有机阴离子与磷酸根离子竞争专属位点能力下降，导致土壤中吸附态磷含量增加，速效磷含量下降。

图3 臭氧水处理前后不同深度土柱土壤的养分含量

2) 速效钾。10 cm土层中，臭氧水处理使速效钾含量显著降低，降低55.9%， 20 cm土层速效钾含量降低24.8%，与对照无显著差异， 30 cm土层经臭氧水处理后，速效钾含量无明显变化。

3) 有机质。臭氧水处理后，不同深度土壤有机质含量均显著降低，土层10 cm、20 cm和30 cm土层土壤的降幅分别为38.8%、43.9%和36.4%。

3 结论与讨论

试验表明，在臭氧水处理后1 h的细菌、真菌、放线菌灭活率分别为93.25%、91.38%和79.65%，并且在其余处理时间内3种菌种的灭活率均在62%以上。虽然臭氧水能显著减少土壤中细菌、真菌、放线菌的数量，但是随着臭氧水分解，土壤微生物数量随着时间延长而缓慢增加。

臭氧水处理24 h后，细菌、真菌、放线菌的灭活率随着土壤深度的增加而降低，在10 cm深度的土壤细菌、真菌、放线菌的灭活率分别为33.27%、39.62%和28%，但随着表层土柱土样深度的增加而细菌、真菌、放线菌的灭活率显著降低。

臭氧水浇灌后与对照(蒸馏水)相比，随时间变化，土壤中的速效钾含量整体上升，臭氧水处理5 h的速效钾含量达到最大，比初始增加10.1%，而有机质含量显著降低，但速效磷无明显变化。臭氧水处理24 h后，在10 cm土层中，有机质、速效磷和速效钾含量明显降低，分别较对照降低38.8%、39.1%和55.9%，在20 cm和30 cm土层中，速效磷和速效钾含量降低不明显，有机质含量变化显著，分别较对照降低43.9%和36.4%。

臭氧水处理土壤后，土壤微生物的菌落数趋势大致为先锐减后慢慢升高，而造成这一现象的原因可能与土壤水分下渗速率以及臭氧水半衰期有关。由于目前科学界尚未对臭氧水在土壤中的下渗进行研究，故参考水在土壤中的下渗情况，从有关土壤水分入渗的研究[25]可以得知，水的初始入渗量快，经过一定时间后到达稳定入渗，此时入渗率较慢。得出以下推测：在浇灌臭氧水后，开始时，臭氧水以较快速度渗入表层土壤，但当达到稳定入渗后，由于臭氧水的半衰期仅为20 min，而其尚未下渗到深层土壤便已分解，故对下层土壤微生物影响较弱。

对于土壤养分含量，臭氧水处理后，速效磷含量与对照差异不显著的结果与荆世杰等提出的速效磷含量显著降低的结论不相符[21]。可能是由于此试验臭氧水浓度偏低，不足以将土壤中有机质氧化彻底，从而增加土壤中有机阴离子与磷酸根离子的竞争，使其吸附固定。土壤中钾主要以速效钾、缓效钾和相对无效性钾形态存在，它们之间存在动态平衡[24]。速效钾含量在经臭氧水处理后，24 h内的含量均高于对照，可能由于臭氧水直接将土壤中的缓效钾转化为速效钾，而速效钾含量随着土层的加深逐渐减少，在30 cm土层的变化不显著，由此可知，臭氧水入渗过程降低速效钾含量，这一结论与吴启佳等研究结果相似，可能的原因： 1) 由于臭氧水处理使土壤氧化彻底，土壤速效钾溶于水向下迁移；2) 土壤有机质含量下降，降低有机质中微量元素对钾的吸附、鳌合，使其淋洗损失。经臭氧水处理的有机质含量与空白相比在24 h显著降低，土层10 cm、20 cm和30 cm土层土壤的降幅分别为38.8%、43.9%和36.4%，表明臭氧水处理能显著降低土壤有机质，使其矿化度提升。试验结果表明，臭氧水处理土壤后，其强氧化性能杀死土壤微生物，可能杀死土传病害的来源，减少设施农业土传病害的发生，而且还调整了土壤养分含量，使土壤逐渐恢复健康、养分比例趋向合理。