高效液相色谱多波长法同时测定中风合剂中梓醇、哈巴苷、绿原酸和芍药苷含量

江建丽

（福建省南平市食品药品检验检测中心，福建 南平 353000）

中风合剂是由太子参、黄芪、玄参、生地、忍冬藤、白芍、木瓜等11味中药组成的复方制剂，具有益气养阴、活血通络的功效[1]，用于中风恢复期的半身不遂、肢体麻木、口眼斜、舌强语蹇的治疗，疗效较好。原标准中只是对制剂的性状、薄层色谱、检查项下进行检验，未对制剂中玄参、生地、忍冬藤、白芍的有效成分进行含量测定[2-3]。为有效控制中风合剂的质量，本研究中根据处方的剂型特点，对制剂中哈巴苷（玄参的有效成分）、梓醇（生地的有效成分）、绿原酸（忍冬藤的有效成分）、芍药苷（白芍的有效成分）进行了含量测定[4-9]，现报道如下。

图1 高效液相色谱图

1 仪器与试药

1.1 仪器

Thermo ultimate3000型高效液相色谱仪（包括自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器，赛默飞世尔公司）；梅特勒XS205DU型电子天平（德国赛多利斯公司）；ABY-2001-U型超纯水机（重庆艾科浦公司）。

1.2 试药

中风合剂（批号分别为 20161215，20170114，20170209，福建省南平市人民医院医院制剂）；梓醇对照品（批号为 110808-201210，含量为 98.1%），哈巴苷对照品（批号为111729-201204），绿原酸对照品（批号为110753-201314，含量为 96.6% ），芍药苷对照品（批号为110736-201741，含量为95.7%），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：WelchXB-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.06%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0 ～5 min时 0→2%B，5～12 min时 2%→10%B，12～25 min时 10%→25%B，25～38 min时 25%→2%B，38～40 min时 2%B）；流速：1.0 mL ／min；检测波长：200，231，327 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

分别取梓醇 19.88 mg、哈巴苷 19.25 mg、绿 原 酸17.56 mg 和芍药苷对照品 30.12 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇，分别制成质量浓度梓醇为 0.780 1 g ／L（Ⅰ）、哈巴苷为 0.770 0 g／L（Ⅱ）、绿原酸为 0.678 5 g ／L（Ⅲ）、芍药苷为 1.153 0 g ／L（Ⅳ）的对照品贮备溶液，再分别精密吸取各5.0 mL，置25 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液（Ⅴ，梓醇为 0.156 g ／L、哈巴苷为 0.154 g ／L、芍药苷为 0.230 6 g ／mL、绿原酸为 0.135 7 g ／L）。精密吸取中风合剂样品5mL，置25mL容量瓶中，加50%甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按处方比例制备不含玄参、忍冬藤、生地和白芍的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

阴性干扰试验：分别取2.2项下3种溶液各适量，在拟订色谱条件下，依法进样。阴性对照品溶液的色谱图中，在梓醇、哈巴苷、绿原酸和芍药苷色谱峰保留时间的相应位置上无干扰峰出现。色谱图见图1。

线性关系考察：分别精密吸取混合对照品溶液1，2，3，4，5，6，7，8 mL，置 10 mL 容量瓶中，加 50% 甲醇稀释至刻度，即得系列对照品溶液。再分别精密吸取系列对照品溶液各10 μL，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标、对照品进样量（X）为横坐标进行线性回归。结果见表1。

表1 各成分回归方程、相关系数及线性范围（n＝8）

精密度试验：精密吸取2.2项下混合对照品溶液10 μL，按拟订色谱条件连续进样6次，测定。结果梓醇、哈巴苷、绿原酸和芍药苷峰面积的RSD分别为0.82%，0.34%，0.15% ，1.56%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取供试品溶液（批号为20161215），室温放置，分别于 0，2，4，6，8，10，12，24 h 时按拟订色谱条件进样测定。结果梓醇、哈巴苷、绿原酸和芍药苷峰面积的RSD分别为 0.62%，0.71%，0.13%，0.24%（n＝8），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：精密量取同一批（批号为20161215）样品6份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果梓醇、哈巴苷、绿原酸和芍药苷峰面积的RSD分别为1.25%，1.62%，1.21%，1.34%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取同一批（批号为20161215）样品2.5 mL，共6份。每份样品分别精密加入梓醇对照品贮备液（Ⅰ）0.97mL、哈巴苷对照品贮备液（Ⅱ）0.84mL、绿原酸对照品贮备液（Ⅲ）0.45 mL和芍药苷对照品贮备液（Ⅳ）1.71 mL，依法制备供试品溶液，依法进样测定并计算加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n＝6）

2.4 样品含量测定

取3批样品，依法制备供试品溶液，再按拟订色谱条件进样测定并计算含量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果（g／L）

3 讨论

2015年版《中国药典（一部）》收载有梓醇、哈巴苷、绿原酸及芍药苷的高效液相色谱法，但未收载同时测定这4种组分的试验[1]。试验前，本研究中也考虑过使用紫外检测器来同时检测这4个成分，但因操作较烦琐，而使用二极管阵列检测器（DAD）检测更加高效和节省时间。

曾取混合对照品溶液（Ⅴ），通过U3000型液相色谱仪（配有DAD检测器），在190～500 nm波长范围内扫描。结果发现，梓醇和哈巴苷于200 nm波长处吸收值最大，绿原酸于327 nm波长处吸收值最强，芍药苷于231 nm波长处吸收值最大，并在此波长处无干扰。200 nm波长处虽4个特征峰形能分离，但芍药苷与绿原酸的响应值相对较低。因此，参照以上色谱条件，设置DAD检测器为3个不同紫外波长同时测定4种待测成分，即于200 nm波长处测定梓醇、哈巴苷含量，于327 nm波长处测定绿原酸含量，于231 nm波长处测定芍药苷含量，各峰形基本上都能达到较理想的分离效果。此外，也尝试对木瓜的有效成分齐墩果酸和熊果酸进行考察，因这两者是同分异构体，液相色谱法的分离效果不佳，故未对制剂中木瓜的含量进行测定，这是本试验的不完善之处。以后可考虑通过液相色谱-质谱联法区分。

分别考察了10%，30%，50%，70%，90%甲醇和甲醇6种稀释溶剂对提取结果的影响[4]。结果发现，不同体积分数的甲醇对哈巴苷、绿原酸、芍药苷的含量提取基本一致，而梓醇采用50%甲醇为溶剂，含量提取更高。因此，选择50%甲醇作为稀释溶剂。

综上所述，采用高效液相色谱多波长法同时测定制剂中多个组分，较单通道检测方法操作简单，减少了操作步骤，节省了时间，可用作中风合剂的质量控制。