雌二醇通过上调M-CSF表达促进乳腺癌教化单核细胞

季秋兰　丁景弦

【摘要】 目的：研究雌二醇对MCF-7细胞教化单核细胞分化为肿瘤相关巨噬细胞的影响。方法：分别用10 nM雌二醇及10 nM雌二醇+1 μM他莫昔芬处理雌激素受体阳性乳腺癌细胞株MCF-7，48 h后收集细胞培养上清，利用细胞因子芯片检测不同处理组单核细胞活化相关蛋白与空白对照组MCP-1及M-CSF的表达差异，利用细胞Transwell niche检测其对单核细胞活化功能的影响。结果：Bio-Rad细胞因子芯片检测发现空白对照组、雌二醇组及雌二醇+他莫昔芬组细胞上清中CSF1浓度分别为（1.83±0.18），（29.71±8.06）及（10.90±2.38）pg/mL，MCP-1分别为（31.33±2.40），（75.37±5.50）和（41.97±5.80）pg/mL，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。雌二醇处理组CD163的mRNA水平是对照组（76.83±12.80）倍，他莫昔芬加雌二醇组是对照组的（6.5±1.71）倍，比较差异有统计学意义（F=96，P<0.01）。对照组、雌二醇处理组及他莫昔芬加雌二醇处理组每个高倍镜视野内U937细胞数目分别为（28±6）、（188±16）及（82±9）个，比较差异有统计学意义（F=160，P<0.05）。结论：雌二醇通过上调激素依赖型乳腺癌细胞株MCF-7表达M-CSF从而增强其对单核细胞的教化，而他莫昔芬可部分阻断其发挥效应。

【关键词】 激素依赖型乳腺癌; 雌二醇; 他莫昔芬; MCP-1; M-CSF

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Estradiol on educating monocyte differentiation into tumor associated macrophage in MCF-7 coculture system.Method：48 h after treated with 10 nM Estradiol or10 nM Estradiol+1 μM Tamoxifen，MCP-1 and M-CSF in human breast cancer cell line MCF-7 culture supernatant were detected，they were given Transwell niche to further explore their effects on the recruitment and activation of monocyte.Result：Bio-Rad cytokine chip assay showed that the M-CSF concentration in the supernatant of blank control group，Estradiol group and Estradiol+Tamoxifen group were （1.83±0.18），（29.71±8.06） and （10.90±2.38） pg/mL，and the MCP-1 concentration were （31.33±2.40），（75.37±5.50） and （41.97±5.80） pg/mL respectively，the differences were statistically significant（P<0.05）.The level of CD163 mRNA in estradiol treatment group was （76.83±12.80） times higher than that in control group，and that in Estradiol+Tamoxifen group was （6.50±1.71） times higher than that in control group （F=96，P<0.01）.The number of U937 cells in the control group，the Estradiol treatment group and the Estradiol+Tamoxifen treatment group were （28±6），（188±16） and （82±9） respectively，the difference was statistically significant （F=160，P<0.05）.Conclusion：Estradiol may promote hormone dependent breast cancer cell lines MCF-7 to secrete MCP-1 and M-CSF，thereby educate monocyte differentiation into tumor associated macrophage，while Tamoxifen may partially block the effect.

【Key words】 Hormone dependent breast cancer; Estradiol; Tamoxifen; MCP-1; M-CSF

First-authors address：The Fourth Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.01.007

乳腺癌是全球范圍内女性最常见的恶性肿瘤，美国癌症统计数据显示女性一生中患上乳腺癌的概率约1/8[1]。尽管与其他实体瘤相比乳腺癌患者预后较好，然而不同类型乳腺癌之间预后差异较大。根据乳腺癌细胞雌激素和/或孕激素受体表达情况可分为激素依赖型乳腺癌和激素非依赖型乳腺癌，其生存复发模式相差很大。Saphner等[2]研究发现激素受体阳性乳腺癌总体年复发风险较激素受体阴性者低，且复发时限呈现双峰分布，即在术后3年及术后7年各有一复发高峰，而激素受体阴性患者复发高峰主要是在手术后2年。病理学之父Stephen Paget医生于1889年首次提出了肿瘤起源的“种子与土壤”理论，该学说认为微环境可以影响肿瘤细胞的生长、侵袭和转移[3]。近年来，越来越多的学者将关注点转移到肿瘤细胞赖以生存的微环境上。肿瘤微环境即肿瘤中的非肿瘤细胞成分，主要包括细胞外基质和各种基质细胞，它们为癌细胞发生发展提供养分和支撑。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是微环境中的主要细胞成分之一，在肿瘤发生发展中起到重要作用。文献[4-7]报道TAMs丰度是乳腺癌独立的预后因素并有望成为乳腺癌治疗的新靶点。

TAMs是由血液中的单核细胞游出进入组织后在MCP-1、M-CSF、IL-6及IL-10等相关细胞因子的作用下分化而成，通常具有M2表型。TAMs在組织修复、基质重塑和血管生成等方面起到重要促进作用，并促进肿瘤的发生发展。乳腺癌细胞可通过分泌MCP-1及M-CSF进而招募单核细胞并教化其分化为M2型TAMs，TAMs增加血管内皮生长因子的合成，从而为肿瘤细胞生长提供养分促进肿瘤生长。研究表明激素非依赖型乳腺癌细胞通常高表达MCP-1及M-CSF，而且MCP-1及M-CSF的表达水平与乳腺癌的高侵袭和高转移成正相关[8]。笔者前期研究发现MCF-7细胞在体外常规培养时具有高增殖能力，免疫细胞化学显示其Ki67阳性比例高，然而在移植瘤模型中不添加雌激素时MCF-7细胞株却不能在SCID小鼠形成移植瘤。本研究拟在前期研究的基础上阐述雌激素对MCF-7乳腺癌细胞教化单核细胞活化分化的影响，结合临床为他莫昔芬内分泌治疗提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞 人乳腺癌细胞株MCF-7细胞原购自美国ATCC细胞库，U937细胞株由复旦大学马端教授馈赠。GFP-PURO双标稳定表达U937细胞系及RFP-NEO双标稳定表达MCF-7细胞系由本人攻读博士学位期间建立[9]。

1.2 药物和试剂 RPMI 1640细胞培养液（Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），雌二醇及他莫昔芬（Sigma公司），RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒以及实时荧光定量PCR试剂盒均购自日本TaKaLa公司，细胞因子检测试剂盒由Bio-Plex公司专门制备。

1.3 仪器 CO2培养箱购自Thermo公司，Transwell板购自康宁公司，实时荧光定量PCR仪购自Bio-Rad公司。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 将含5×103个MCF-7细胞的完全培养基200 μL接种于96孔板中，细胞贴壁生长后吸出培养上清，向其中分别加入100 μL无血清培养基、10 nM雌二醇及10 nM雌二醇+1 μM他莫昔芬无血清培养基继续培养48 h后收集上清，200 g离心5 min除去细胞碎片，相关实验操作参考查锡良及沈祥春等发表文献[10-11]，收集上清放置于-80 ℃冰箱保存待做细胞因子检测。

1.4.2 细胞因子芯片检测MCP-1及M-CSF浓度本实验预订的Bio-plex细胞因子芯片是利用磁珠吸附原理检测不同培养上清中单核细胞分化相关细胞因子MCP-1及M-CSF浓度，实验操作按照产品说明书操作流程进行。

1.4.3 MCF-7乳腺癌细胞与U937细胞共培养 将不同实验组中5×105个MCF-7细胞接种于Transwell板（6孔，孔径0.4 μm）上室中，下室种5×105个U937细胞，共培养48 h后观察空白对照组、10 nM雌二醇处理组及10 nM+1 μM他莫昔芬处理组乳腺癌MCF-7细胞对U937细胞教化分化为M2型TAMs的差异。

1.4.4 逆转录实时定量PCR验证雌激素对MCF-7乳腺癌细胞教化单核细胞分化 U937细胞与不同处理组MCF-7细胞共培养48 h后，利用总RNA提取试剂盒Trizol按实验流程提取总RNA，利用TaKaLa试剂盒反转录得到cDNA。利用real-time PCR检测不同处理组U937细胞CD163表达差异。GAPDH作为内参基因，扩增片段引物系列见表1，PCR反应条件参考既往发表文献[12]。

1.5 统计学处理 应用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 雌二醇对MCF-7细胞MCP-1及M-CSF表达的影响 空白对照组、雌二醇处理组及雌二醇+他莫昔芬处理组乳腺癌细胞株MCF-7培养上清中单核细胞分化相关细胞因子MCP-1及M-CSF蛋白浓度分别为（31.33±2.40）、（75.37±5.50）及（41.97±5.80）pg/mL，（1.83±0.18）、（29.71±8.06）及（10.90±2.38）pg/mL，不同处理组间MCP-1及M-CSF浓度差异均有统计学意义（F=68，P<0.01）。雌二醇可促进MCF-7细胞分泌MCP-1及M-CSF，而他莫昔芬可部分阻断该效应。见图1。

2.2 雌二醇处理MCF-7细胞对共培养体系中U937细胞教化影响 MCF-7细胞与U937细胞共培养48 h后U937细胞形态发生改变，由光滑小圆形悬浮细胞部分转变成为不规则形细胞，并有部分细胞呈现贴壁生长特性，见图2。空白对照组、雌二醇处理组及雌二醇+他莫昔芬处理组MCF-7细胞与U937细胞共培养，雌二醇处理组与U937细胞共培养48 h后CD163的mRNA水平经RT-qPCR检测M2型巨噬细胞较对照组明显提高，而他莫昔芬可以部分阻断其效应，雌二醇处理组CD163的mRNA水平是对照组（76.83±12.80）倍，他莫昔芬加雌二醇组是对照组的（6.50±1.71）倍，比较差异有统计学意义（F=96，P<0.01）。见图3。对照组、雌二醇处理组及他莫昔芬加雌二醇处理组每个高倍镜视野内U937细胞数目分别为（28±6）、（188±16）及（82±9）个，比较差异有统计学意义（F=160，P<0.05），表明雌二醇能增强MCF-7细胞对U937细胞的教化作用，而他莫昔芬可部分阻断这种效应，见图4。

3 讨论

雌二醇在激素依赖型乳腺癌的发生和发展过程中发挥重要作用，是癌细胞赖以生存的有利“土壤”[13]。研究表明，雌二醇主要通过与雌激素受体结合来发挥促肿瘤效应，然而具体下游信号通路机制尚不明确。他莫昔芬作为一种雌激素受体调节剂，是一种临床上常见的激素依赖型乳腺癌患者内分泌治疗药物。他莫昔芬通过与雌二醇竞争性结合雌激素受体，从而阻断雌二醇对激素依赖型乳腺癌细胞的促进作用，可有效降低激素依赖型乳腺癌患者的复发死亡风险[14-15]。TAMs是肿瘤微环境中的重要细胞组成成分，主要通过促进新血管生成和瘤旁炎性反应等来发挥其在肿瘤生长、转移的作用。