藏药秦紫消癖丸质量标准研究

汪 晶1,3 杨忠辉2 彭毛才让2 陈惟思1,3 索果佳2 黄一平1,3 曹 鹏1,3 项欠本

1.南京中医药大学附属中西医结合医院，江苏 南京 210028；2.青海省海南藏族自治州藏医院，青海 海南 813000；3.江苏省中医药研究院，江苏 南京 210028

藏族医药具有民族特色，是我国传统医药的重要组成部分。藏药秦紫消癖丸系青海省海南州藏医院治疗乳腺增生的临床经验方，由秦艽花、塞北紫堇、冬葵叶、水柏枝等5味药材组成，具有调补冲任、化痰软坚、祛瘀散结等功效，主要用于乳腺增生症，症见乳房疼痛及乳房肿块[1]。该制剂传统剂型为水泛丸，制备工艺繁琐，周期长，且微生物限度难以控制[2-4]，而改进后的浓缩丸将冬葵叶、水柏枝进行水提取后与其他三味药材细粉混匀，采用塑制法制丸，生产效率大大提高，服用量减小，为适应中药制剂制造规范化、标准化，为了提高药品质量标准，保证临床疗效及用药安全，试验进行秦紫消癖丸质量标准研究，分别采用显微鉴别、薄层色谱鉴别、HPLC等方法对制剂进行质量控制，以期为民族药医疗机构制剂的开发及质量控制提供可靠的实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260 LC高效液相色谱仪公司(四元泵、自动进样器、DAD检测器、柱恒温箱；美国安捷伦)；ZF-20C暗箱式紫外分析仪；AT 201型1/10 万以及 XP6 型 1/100万电子天平电子天平(瑞士梅特勒公司)；KQ-5200E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；AK-55型流水式粉碎机、AW-96型台式全自动制丸机(温岭市奥力中药机械有限公司)；Millipore型纯水器(美国Millipore公司)；硅胶G、GF254薄层板(青岛海洋化工厂)。

1.2 材料 龙胆苦苷对照品( 批号: 110770-201515，中国食品药品检定研究院)；獐牙菜苷对照品(批号：MUST-17073009，成都曼思特生物科技有限公司)；原阿片碱对照品(批号为: 110853-201404，中国食品药品检定研究院)。甲醇、乙腈(色谱纯，美国TEDIA公司)；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。秦紫消癖丸样品(批号：20170601、20170602、20170603，江苏省中医药研究院)。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别 取本品加少量水溶散后，过滤，滤渣再用水合氯醛加热透化，稀甘油封片，镜检，记录显微特征。结果：花粉粒类圆球形，表面雕纹不明显，直径36 μm[5]，有3个萌发孔(秦艽花)。叶表皮细胞不规则形，垂周壁平直或弯曲，气孔不定式，副卫细胞4～5个(塞北紫堇)。显微特征如图1。

2. 2 TLC鉴别

2.2.1 秦艽花 取藏药秦紫消癖丸1.0 g，研细(过4号筛)，置于100 mL三角锥形瓶中，加入甲醇25 mL，超声处理30 min，将溶液摇匀，用滤纸滤过，制备成供试品溶液[6-8]；另取龙胆苦苷对照品适量，加甲醇制成每 l mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。按处方工艺制备得不含秦艽花丸剂，以相同方法制成阴性对照品溶液[9]。照《中国药典》2015 年版四部通则0502薄层色谱法试验[10]，吸取对照品溶液1 μL，供试品溶液和对照品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶GF254 薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水( 20∶2∶1 )为展开剂，预饱和15 min，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254 nm)下检视。由图2可知，供试品色谱在与对照品色谱相应位置上有显相同颜色斑点，阴性对照无干扰[11-13]。

2.2.2 塞北紫堇 取藏药秦紫消癖丸5.0 g，研细(过4号筛)，置于三角锥形瓶中，加二氯甲烷-甲醇-浓氨试液 ( 5∶1∶0.1 )混合溶液40 mL，超声处理30 min，滤过，滤液浓缩至干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液[14-16]。另取原阿片碱对照品，加甲醇制成每l mL含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。按处方工艺制备得不含塞北紫堇丸剂，以相同方法制成阴性对照品溶液[17-18]。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液( 10∶8∶2∶0.3 )为展开剂，预饱和15 min，展开，取出，晾干，喷以改良碘化铋钾试液[19]。供试品色谱在与对照品色谱相应位置上有显相同颜色斑点，阴性对照无干扰。

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适应性 采用X-Bridge C18色谱柱(250 ×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-0.4%甲酸水(22∶78)；流速1.0 mL/min；柱温25 ℃；采用DAD紫外检测器检测，检测波长为245 nm；进样量10 μL，理论塔板数按龙胆苦苷计算，应不低于4000[20-22]。

2.3.2 溶液制备 对照品溶液的制备：称取龙胆苦苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇溶解，定容，即得0.4859 mg/mL龙胆苦苷贮备液。称取獐牙菜苷对照品适量，精密称定，甲醇溶解并定容至量瓶中，即得0.1339 mg/mL獐牙菜苷贮备液。分别精密吸取上述溶液5 mL于10 mL量瓶中，70%甲醇稀释至刻度，即得含龙胆苦苷0.2429 mg/mL、獐牙菜苷0.0669 mg/mL的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：将丸剂研细，取约0.4 g，精密称定，置三角锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，取出，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，取少量溶液于离心管中高速离心，上清液用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。

阴性对照溶液制备：按处方比例称取除秦艽花以外的药材，按本品制备工艺及供试品制备方法制成阴性对照溶液。

2.3.3 专属性考察 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，在“2.3.1”项下色谱条件下进样测定，记录色谱图。结果表明，龙胆苦苷及獐牙菜苷色谱峰在供试品、对照品溶液色谱图中保留时间一致，阴性供试品在此处未有吸收峰，表明在上述HPLC测定条件下，无阴性干扰，建立的方法专属性良好。结果见图4。

2.3.4 线性关系考察 精密量取混合对照品溶液0.5、1、2、3、4 mL置于5 mL量瓶中，70%甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取10 μL，分别注入高效液相色谱仪，按“2.3.1”项下色谱条件测定。以对照品浓度对峰面积进行线性回归分析，得到回归方程分别为龙胆苦苷Y=11.787X+15.009(r=0.9997)、獐牙菜苷Y=17.073X-10.094(r=0.9997)，线性范围分别24.295～194.360、6.695～53.560 μg·mL-1，结果表明线性关系良好。

2.3.5 精密度试验 精密吸取上述混合对照品溶液(含龙胆苦苷0.0972 mg/mL、獐芽菜苷0.0268 mg/mL)10 μL，按上述色谱条件连续进样6次，测得龙胆苦苷与獐牙菜苷峰面积RSD分别为1.08%、1.70%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性试验 取同一批样品，研细，按供试品制备方法平行制备6份，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得龙胆苦苷、獐牙菜苷平均含量分别为6.0510，2.0307 mg/g，RSD分别为2.90% 、2.31%，表明该方法重复性良好。

2.3.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12，24 h进样测定，测得龙胆苦苷、獐牙菜苷峰面积的RSD分别为2.28%、 2.57%，表明在室温条件下，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.8 加样回收率试验 取已测定的样品0.2 g，精密称定，共6份，分别精密加入龙胆苦苷与獐牙菜苷混合对照品溶液(含龙胆苦苷0.2429 mg/mL、0.0669 mg/mL) 5 mL，按“2.3.2”项下供试品制备方法制备样品，进样量为10 μL，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表1。

表1 秦紫消癖丸加样回收试验结果 (n=6)

2.3.9 样品含量测定 分别取3批秦紫消癖丸样品，精密称定，按照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.3.1”项下色谱条件进样测定，计算龙胆苦苷和獐芽菜苷含量，测定结果见表2。参考3批样品含量测定结果，暂将样品含量限度定为本品含龙胆苦苷不得低于5.4 mg/g，獐芽菜苷不得低于1.8 mg/g。

表2 秦紫消癖丸含量测定结果 /mg/g

3 讨论

藏药秦紫消癖丸是根据传统藏医药理论，采用现代制剂技术将秦紫消癖丸制成浓缩丸，减小了服用量，提高了患者的依从性；降低微生物污染几率；提高生产效率，促进民族药现代化的发展。

秦紫消癖丸中秦艽花的花粉粒、塞北紫堇的气孔易检出，其特征明显，但专属性较差，因此未列入质量标准中。在鉴别秦艽花的TLC试验中，以乙酸乙酯-甲醇-水(10∶2∶1)、乙酸乙酯-甲醇-水(20∶2∶1)不同比例展开剂比较斑点分离情况后选择分离效果更好的乙酸乙酯-甲醇-水(20∶2∶1)为展开条件；在鉴别塞北紫堇TLC试验中，比较不同展开系统环己烷-乙酸乙酯-二乙胺(16∶3∶1)、正己烷-乙酸乙酯-三乙胺(16∶3∶2)、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水(10∶8∶2∶0.3)，确定了以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水(10∶8∶2∶0.3)为展开系统的分离效果最佳，选择改良碘化铋钾试液为显色剂，显色清晰。在TLC鉴别试验中水柏枝与冬葵叶阴性有干扰，故未列入质量标准。

在HPLC含量测定时，通过全波长扫描发现龙胆苦苷在245 nm和275 nm均有较大吸收，獐牙菜苷在245 nm处有最大吸收，且无阴性干扰，所以选择245 nm处为检测波长。供试品溶液制备过程中比较了回流提取与超声提取，结果发现对秦艽花中龙胆苦苷的提取并无显著性区别，考虑到超声提取操作更加简便，选择超声提取。提取溶剂比较了30%、50%、70%、100%浓度甲醇，发现30%、50%、100%浓度的甲醇提取的龙胆苦苷峰均拖尾，70%甲醇提取时龙胆苦苷峰形好，提取率更高，因此选择70%甲醇为提取溶剂。比较了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.4%甲酸水等多种流动相体系，发现以甲醇-0.4%甲酸水为流动相洗脱时分离效果最好；本文的研究工作为秦紫消癖丸的质量控制提供了依据。