6-姜辣素对人乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响及机制

于杰滨 邵明举

(山东大学第二医院急诊科，山东 济南 250033)

乳腺癌约占所有女性肿瘤的25%，每年约有100多万女性新诊断为乳腺癌，其中有50万人会死于乳腺癌〔1〕。手术、化疗、内分泌治疗及放疗仍作为目前治疗乳腺癌的主要方法，但这些治疗手段并不能完全有效地对抗乳腺癌。此外，放化疗及激素治疗通常会伴随一些不可耐受的副反应〔2〕。目前，在天然中草药中寻找具有抗癌效果的小分子已成为肿瘤药物研发的重点〔3〕。生姜，最初起源于东南亚地区，随后被引入世界多地种植，其作为日常生活中的调味品和中药已有几千年的历史〔4〕。6-姜辣素作为生姜的主要成分，现代药理学已证实其具有抗氧化活性、抑制血小板聚集、保护胃黏膜等功效〔5〕。近年来，已有研究发现其在宫颈癌、结直肠癌、肺癌、骨肉瘤中具有抗癌效果〔6～9〕。6-姜辣素发挥抗癌效果主要通过诱导肿瘤细胞凋亡、发挥细胞毒性、抑制肿瘤血管形成、抑制肿瘤转移等发挥作用〔10〕。虽然报道6-姜辣素可以抑制乳腺癌细胞进展，但未对其具体机制深入研究。本文旨在探究6-姜辣素对乳腺癌增殖和凋亡的影响，并探究其内在分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料 人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231购于中国科学院昆明细胞库；DMEM和RPMI1640培养基购于美国Hyclone公司；胎牛血清购于以色列BI公司；6-姜辣素和二甲基亚砜(DMSO)购于美国Sigma-Aldrich公司；CCK-8细胞增殖和活性检测试剂盒及Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于上海碧云天生物技术公司；一抗抗体促凋亡蛋白(Bad)、兔抗人单克隆抗体(Bax)、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)均购于CST公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)购自沈阳万类生物有限公司；二抗购于北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 细胞培养 人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231分别培养于改良伊格尔培养基(DMEM)和RPMI1640培养基(包含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素)中，并放置于含5%CO2及饱和湿度的细胞孵育箱中37℃培养，每2～3 d给予换液，当细胞长至90%左右，用0.25%胰酶消化离心并重悬，后种于新的培养皿中。

1.3 CCK-8法检测细胞增殖 取对数期生长的MCF-7和MDA-MB-231细胞种于96孔板，每孔5 000个，于培养箱中培养，待4～6 h后细胞贴壁，加入不同浓度6-姜辣素处理(0、10、20、40、60、80、100 μmol/L)乳腺癌细胞24 h，选择60 μmol/L 6-姜辣素分别处理24、36、48 h,每个处理组设置5个复孔。结束后，将旧培养基弃掉并更换为新的完全培养基100 μl/孔，同时加入CCK-8 10 μl，培养箱孵育2 h后使用酶标仪490 nm处检测各孔吸光度。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 将乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231以1×106/孔的浓度种于6孔板内，加入0 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L的6-姜辣素处理24 h，随后用胰蛋白酶消化离心并收集细胞，用提前预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，加入200 μl结合缓冲液，调整细胞密度至1×106/ml，取100 μl缓冲液至流式管内，分别加入5 μl 的Annexin V-FITC和PI，混匀后于室温避光孵育15 min，加入结合液后应用流式细胞仪分析凋亡率。

1.5 Western印迹法检测蛋白表达水平 将长至80%～90%的乳腺癌细胞以不同浓度的6-姜辣素(0 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L)处理24 h，随后用PBS冲洗3次，加入细胞裂解液静置5 min后用刮勺将细胞刮下并收集到1.5 ml EP管内，于冰上放置10 min使其充分裂解，后在4℃离心机中离心15 min，转速15 000 r/min。将上清转移至新的EP管内，并加入1/4体积的5×上样缓冲液于100℃煮沸5 min使其变性。剩余蛋白取5 μl使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒测蛋白浓度。取30 μg蛋白使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行蛋白分离及转膜，将聚偏氟乙烯(PVDF)膜用5%脱脂牛奶封闭1 h，加入目的抗体4℃过夜孵育，TBST洗膜液洗膜3次，10 min/次，后加入二抗室温孵育1 h，TBST洗膜液洗膜3次，10 min/次，使用ECL显影液显影。

1.6 统计学分析 采用SPSS18.0软件进行t检验，方差分析。

2 结 果

2.1 6-姜辣素抑制人乳腺癌细胞增殖能力 使用不同浓度6-姜辣素(0、10、20、40、60、80、100 μmol/L)分别处理乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231各24 h，及60 μmol/L 6-姜辣素分别处理24、36、48 h，利用CCK-8检测肿瘤细胞增殖能力，结果显示与对照组(0 μmol/L 6-姜辣素)相比，6-姜辣素对乳腺癌细胞具有明显抑制作用(P<0.05,P<0.01)，并且该抑制作用呈时间和浓度依赖性，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01,P<0.001)。见表1，表2。

表1 不同浓度6-姜辣素中MCF-7、MDA-MB-231存活率(%)

与对照组相比:1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001,下表同

表2 不同时间60 μmol/L 6-姜辣素中MCF-7和MDA-MB-231存活率(%)

2.2 6-姜辣素促进乳腺癌细胞凋亡 在MCF-7细胞中，对照组(0 μmol/L 6-姜辣素)细胞凋亡率为(4.42±1.12)%，而40 μmol/L和60 μmol/L 6-姜辣素处理组细胞凋亡率分别为(27.39±2.32)%和(41.85±5.08)%，与对照组(0 μmol/L 6-姜辣素)相比，差异均有统计学意义(P<0.001)。人乳腺癌细胞MDA-MB-231中，对照组细胞凋亡率为(5.03±0.92)%，而40 μmol/L和60 μmol/L 6-姜辣素处理组细胞凋亡率分别为(30.45±1.37)%和(47.33±3.63)%，与对照组(0 μmol/L 6-姜辣素)相比，差异均有统计学意义(P<0.001)。

2.3 6-姜辣素影响凋亡相关蛋白的表达 使用不同浓度6-姜辣素〔对照组(0 μmol/L)、40 μmol/L、60 μmol/L〕处理乳腺癌细胞系24 h，利用Western印迹检测促进凋亡蛋白Bad、Bax及抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达。结果显示，MCF-7细胞在对照组(0 μmol/L)、40 μmol/L、60 μmol/L 6-姜辣素中的Bad表达水平依次为24%、46%、74%，Bax表达水平依次为13%、26%、35%，Bcl-2表达水平依次为91%、74%、52%。MDA-MB-231细胞在对照组(0 μmol/L)、40 μmol/L、60 μmol/L 6-姜辣素中的Bad表达水平依次为11%、18%、27%，Bax表达水平依次为7%、14%、24%，Bcl-2表达水平依次为42%、26%、9%。MCF-7细胞，与对照组(0 μmol/L 6-姜辣素)相比，6-姜辣素可以促进Bad、Bax的表达，抑制Bcl-2的表达，差异具有统计学意义(图 2A)；在MDA-MB-231细胞中，可以得到相同的结果，差异具有统计学意义(图 2B)。

2.4 6-姜辣素通过AMPK/mTOR信号通路影响乳腺癌细胞增殖和凋亡 选用MCF-7和MDA-MB-231细胞系，使用不同浓度6-姜辣素(0 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L)处理24 h，利用Western印迹检测p-AMPK和p-mTOR的表达。结果显示,MCF-7细胞在对照组(0 μmol/L)、40 μmol/L、60 μmol/L 6-姜辣素中的p-AMPK表达水平依次为21%、43%、67%，p-mTOR表达水平依次为41%、17%、9%。MDA-MB-231细胞在对照组(0 μmol/L)、40 μmol/L、60 μmol/L 6-姜辣素中的p-AMPK表达水平依次为11%、24%、38%，p-mTOR表达水平依次为56%、27%、14%。与对照组(0 μmol/L 6-姜辣素)相比，6-姜辣素可以促进MCF-7(图 3A)和MDA-MB-231(图 3B)细胞p-AMPK的表达，抑制p-mTOR的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示6-姜辣素可以激活AMPK/mTOR信号通路。

1～3：0、40、60 μmol/L 6-姜辣素；下图同图2 6-姜辣素影响凋亡相关蛋白表达(Western印迹)

图3 6-姜辣素激活AMPK/mTOR信号通路诱导乳腺癌细胞凋亡(Western印迹)

3 讨 论

乳腺癌通常伴随较高的发病率和死亡率。手术联合辅助治疗仍然是目前乳腺癌的主要治疗策略。此外，分子靶向治疗也已渐渐应用在临床上了。但是在治疗侵袭性乳腺癌时，化疗耐药和药物毒性反应通常是导致治疗失败的主要原因。因此，寻找一种能特异并高效杀死乳腺癌细胞的药物显得尤为迫切。

在中国，生姜用来治疗头痛、鼻塞、感冒已有2 500年历史了，而在一些西方国家生姜最早被用来治疗关节炎、风湿病和肌肉不适。除此之外，目前已有研究证实生姜具有抗癌功效。一项流行病学调查显示，由于日常饮食中含有大量生姜，东南亚国家的结肠癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌和其他肿瘤的发病率明显低于一些西方国家〔11〕。生姜主要包括挥发油、姜辣素及二苯基庚烷等三种成分，其中关于姜辣素的研究迄今已有100多年的历史。早在二十世纪90年代，Unnikrishnan就发现姜辣素在体外可以抑制淋巴瘤细胞，但未对其机制做出解释。随后Lee等〔12〕研究证实姜辣素可以通过诱导凋亡抑制人肿瘤细胞增殖。既往已有研究报道，6-姜辣素通过活化p53诱导凋亡进而抑制子宫内膜癌细胞增殖〔13〕。本研究结果提示6-姜辣素可以诱导乳腺癌细胞凋亡。

AMP激活的蛋白激酶AMPK是一种存在于真核生物中高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞能量代谢的调节器，激活AMPK可以调节细胞增殖、凋亡、自噬等多种生命活动〔14,15〕。AMPK激活后可以抑制其下游底物mTOR，进而抑制蛋白合成和肿瘤生长。本研究结果提示6-姜辣素激活AMPK/mTOR信号通路。