五子衍宗方对豚鼠形觉剥夺性近视眼巩膜形态学变化的影响

赵庆一, 杨芸芸, 张新月, 范明峰

(江苏省张家港市中医医院 眼科, 江苏 张家港, 215600)

近视作为一种复杂的多因素疾病，正困扰着全世界近一半的年轻人，而对其发病机制及防治方法的探讨是目前的研究热点[1]。近视屈光度在-6.0 D以上的被称为高度近视，是目前导致视力下降和失明的主要眼病，球后部巩膜呈进行性异常扩张且逐渐变薄，巩膜细胞外基质改变是高度近视不断发展的根本原因。近年来，中医治疗高度近视眼病多有报道，主要采用一些补肾益精类的中药进行治疗，并取得了一定的临床疗效。本实验通过遮盖法，人为干扰豚鼠正常的视觉反馈，从而诱导出形觉剥夺性近视模型[2-3], 并利用电镜检测，从组织形态角度观察五子衍宗方对模型动物巩膜结构的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组: 选择100只2周龄普通级三色健康豚鼠，记录体质量在180～200 g并标记，饲养条件为20～22 ℃室内饲养，光线改变按自然昼夜周期，造模前先喂养1周。豚鼠双眼屈光度检查采用暗室内带状检影镜检影验光的方法，记录造模前豚鼠双眼屈光度，为减少误差，由同一位熟练操作者操作。半透明塑料眼罩遮盖右眼，以诱导形觉剥夺性近视模型的建立，左眼为自身对照眼，不做处理。正常饲养42 d后，再次进行带状检影镜检影验光，随机处死1只豚鼠，摘出眼球，游标卡尺测量眼轴长度及赤道径，确定造模成功。剔除死亡实验鼠，将剩余60只实验鼠随机分为对照组及治疗组，每组30只。对照组不进行干预，治疗组以五子衍宗方灌胃给药30 d后，测定相应指标。

1.1.2 实验用药及制备: 实验中使用的五子衍宗方具体组成为炙黄芪20 g、生地12 g、菟丝子12 g、枸杞子12 g、覆盆子12 g、车前子10 g、五味子10 g、当归10 g、川芎10 g、白芍10 g、石斛10 g。上述药物均一次性购于本院门诊药房，使用清洁凉水浸泡药物30 min后，分别加10倍水、8倍水煎煮60、40 min, 2次煎煮所得药液经混合过滤，浓煎至4 g/mL。根据动物体表面积折合法计算治疗组豚鼠生物给药量为16 g/kg。

1.1.3 主要实验设备: SW-2100眼科A/B型超声诊断仪(天津市索维电子科技有限公司), BX51显微镜(OLYMPUS), LEICA255铺片机, BM450A包埋机(派斯杰医疗)，带状检影镜(苏州六六视觉科技股份有限公司), 4%多聚甲醛固定液(北京华越洋生物科技有限公司)，二甲苯(济南汇丰达化工公司), 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)(北京华越洋生物科技有限公司), LEICA300自动脱水机，乙醇(济南汇丰达化工公司)。

1.2 方法

1.2.1 检测双眼屈光度和眼轴长度: 每5 min使用1%复方托吡卡胺点双眼，共3次，以作散瞳准备, 30 min后于暗室内检影验光，散光度数(D)记作等效球镜的一半(检影验光由同一位专业人员操作完成)。盐酸奥布卡因滴眼液点双眼表面麻醉后, A/B型超声诊断仪手动测量眼轴长度，记录双眼结果，剔除明显异常数据后取平均值。造模后重复检查1次。

1.2.2 电镜观察: 实验结束后，氯胺酮麻醉豚鼠以便操作，标记后立即摘除双侧眼球，小心剔除多余组织，取眼球后部颞侧眼球壁巩膜组织切成，用无齿镊剥离大小约1 mm×1 mm巩膜组织块，置于25 g/L戊二醛溶液中固定, 10 g/L锇酸固定，乙醇梯度脱水、浸透包埋、固化、切片，枸橼酸铅染色, JEM-120OEX透射电镜观察、拍片。

1.3 统计学分析

数据统计学处理应用SPSS 17.0统计分析软件，采用配对t检验方法检验豚鼠造模前后屈光度结果和眼轴结果，同样采用配对t检验方法检验豚鼠造模后左、右眼屈光度结果和眼轴结果，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 双眼屈光度及眼轴

100只豚鼠经正常喂养1周后，检测右眼的屈光度、眼轴和左眼的屈光度、眼轴。造模前所有实验对象双眼屈光度与眼轴相匹配，差异无统计学意义(P>0.05)。遮盖右眼42 d以诱导形觉剥夺性近视，再次检测模型眼(右眼)的屈光度、眼轴及对照眼(左眼)的屈光度、眼轴。对比自身对照眼，模型眼诱导了约(-8.24±1.04) D的相对近视，差异有统计学意义(P<0.05)。3周龄豚鼠的左、右眼眼轴长度无显著差异。形觉剥夺42 d后，模型眼的眼轴显著增长，较实验前结果差异显著(P<0.05)。自然成长42 d后，对照眼的眼轴也随之增长，较实验前结果差异显著(P<0.05)。模型眼的眼轴变化平均幅度大于对照眼。见表1。

表1 豚鼠造模前后屈光度和眼轴的变化

与右眼比较, *P<0.05; 与造模前比较, #P<0.05。

2.2 巩膜电镜下超微结构变化

经透射电镜观察发现，治疗组模型眼和对照组模型眼后部颞侧巩膜厚度相较于自身对照眼均有不同程度降低，对照组对照眼巩膜胶原纤维间隙较小，排列紧致，纤维走向规则，其中均匀分布巩膜成纤维细胞且形态均一，未见典型凋亡细胞。对照组模型眼巩膜胶原纤维走行紊乱，排列间隙增宽扩大，纤维束疏松，断裂明显，其间成纤维细胞分布不均匀，呈柳叶状改变，细胞内线粒体肿胀，染色质固缩周边化，同时可见空泡及典型凋亡小体，细胞外基质减少。治疗组模型眼巩膜胶原纤维走行欠规则，排列可见间隙，可见少量断裂纤维束，其间分布成纤维细胞部分出现皱缩，细胞内有空泡形成，线粒体肿胀，内质网扩张与细胞膜融合，细胞形态改变。见图1。

A、B、C、D为对照组模型眼, E、F、G、H为治疗组模型眼; A、C、D、G放大倍数6 000倍, B、E、F、H放大倍数2 500倍。图1 2组豚鼠后部颞侧巩膜组织电镜检查图

3 讨 论

动物模型的应用可让实验更加直观，为研究近视疾病的病因及进展提供了极有价值的数据。豚鼠具有生长快、成熟周期短、易饲养、易检查等特点[4], 目前被大量用为实验性近视的模型动物。本实验模拟先天性屈光介质混浊或后天性上睑下垂诱发高度近视，通过遮盖干扰小周龄豚鼠的正常视觉反馈，从而诱导出形觉剥夺性近视模型。对近视动物模型的形态学研究[5-6]发现，高度近视眼巩膜纤维层变薄，尤其是后极部，巩膜胶原、蛋白多糖等含量明显减少，胶原纤维结构发生变化。随着眼球发育及近视度数的加深，眼轴的进一步延长，为匹配增大的眼球，后极部巩膜组织主动重塑、拉伸以协调生长，造成胶原纤维梯度排列变化、纤维直径分布紊乱、组织结构重塑，最终导致眼球前后径异常伸长[7-9]。本实验通过电镜观察到治疗组模型眼及对照组模型眼巩膜组织均有不同程度的结构改变，巩膜胶原纤维走行欠规则，排列间隙增宽扩大，纤维束疏松，断裂明显，其间成纤维细胞分布不均匀，细胞内可见空泡，线粒体肿胀，染色质固缩周边化，呈镰刀状改变，并可见典型凋亡小体，细胞外基质减少。这一结果与研究[10]报道的高度近视豚鼠巩膜超微结构变化一致。Annexin V/PI流式细胞分析法[11-12]也证实了高度近视眼巩膜组织存在细胞凋亡。

中医认为“目得血而能视”“五脏六腑之精气皆上注于目而为之精”，说明眼睛之所以能有视觉功能，必须依赖于五脏六腑精气及血液的滋养。肾、脾互为先后天之本，是人体气血生化之源。脾肾两虚者，生化乏源，又则肝开窍于目，肝血虚者，目不能养，故发为高度近视。五子衍宗方是由补肾名方五子衍宗丸加减得来，全方补肾益精，健脾益气，养肝明目，生津活血，使得气血运行通畅，精气充足滋养于目。本实验结果显示，相较于对照组模型眼，治疗组模型眼的近视进程及眼轴增长相对较为缓慢，其巩膜组织超微结构变化也相对较小，这说明治疗组模型眼近视进程得到了抑制。有实验[13-15]证实，五子衍宗丸的活性成分可通过促进神经干细胞增殖和诱导神经细胞分化而起到神经保护和改善神经病理损伤的作用。推测五子衍宗方可能通过某种途径改善巩膜胶原纤维结构异常改变，延缓眼轴增长，但其具体作用机制有待进一步研究。