沙棘粕提取物对H2O2诱导的B16F10细胞氧化损伤的保护及修复

张佳婵 王昌涛* 易思雨 王蕴涵 赵 丹 孙宝国

（1 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心 北京工商大学 北京100048 2 北京工商大学理学院 植物资源研究开发北京市重点实验室 北京100048 3 北京工商大学食品学院 食品添加剂与配料北京高校工程研究中心 北京100048）

氧化应激是机体不可避免的一种状态，机体在氧化应激状态下会产生自由基，同时也会激发机体产生保护性应激反应来清除自由基，如抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶 （Glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（Catalase，CAT）等。正常情况下机体内氧自由基的生成和消除处于动态平衡状态。当氧化损伤在体内的聚集程度超过机体抗氧化系统自身的清除能力时，致氧自由基大量生成，引起脂质过氧化、DNA 氧化损伤和蛋白质的表达异常[1-3]。近年来人们专注于对天然抗氧化活性成分的发掘和作用机制的研究，如高丽参提取物[4]、海带酶解物[5]、蔓越莓提取物[6]、大蒜提取物[7]等能直接清除自由基，提高抗氧化酶的活性以及降低过氧化产物，如丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，发挥防护氧化应激损伤的作用。

沙棘是西北地区特有的高原特色水果。沙棘粕是沙棘籽经过脱油处理后的副产物，前期研究证实沙棘粕提取物（SBSE）中富含丰富的黄酮、多酚、原花青素等活性成分，具有显著的抗氧化、抗衰老功能[8-10]。前期研究仅限于化学水平清除自由基或对细胞的直接刺激方面，未针对氧化损伤进一步探究。SBSE 干预氧化应激损伤的作用时期是在防护阶段还是在修复阶段不得而知。本试验针对防护与修复两个阶段对SBSE 进行研究。首先建立H2O2诱导的氧化损伤模型，利用流式细胞术对模型细胞进行评价；其次，为探讨SBSE 对氧化应激损伤的保护作用，本课题组利用H2O2刺激经SBSE 预处理的B16F10 细胞，检测细胞活力及细胞内抗氧化酶系含量和MDA 的积累水平；为探讨SBSE 对氧化应激损伤的修复作用，用一系列SBSE 处理氧化应激损伤模型，检测细胞活力及细胞内GSH-Px、SOD、CAT 和MDA 的水平。本课题组旨在研究SBSE 对H2O2诱导的氧化应激损伤的干预作用，并初步分析其可能机制，为SBSE 的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙棘粕，青海康普生物科技股份有限公司提供，均烘干、粉碎、过筛；胰酶（1∶250），美国Sigma Aldrich 公司；DMEM 培养基、新生牛血清、PBS、1×105U/L 青霉素、100 mg/L 链霉素，美国GIBCO生命技术公司。Annexin V-PE/7-AAD 细胞凋亡检测试剂盒，美国BD 医疗器械有限公司；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）检测试剂盒、超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD） 检测试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）检测试剂盒、脂质氧化（malonaldehyde，MDA）检测试剂盒，碧云天生物技术有限公司。

B16F10 细胞，中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。

1.2 仪器与设备

BS2202S 型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；Elx-808 型酶标仪，美国Bio-Tek 公司；T6 新世纪紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；流式细胞仪FACS Calibur，应用CellQuest 软件（Becton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA），美国BD 公司；DSHZ-300 恒温水浴振荡器，江苏省太仓市实验设备厂；2-16N 型医用高速离心机，湖南恒诺仪器设备有限公司；YJ-2450 医用超净工作台，苏州净化设备厂；CO2培养箱，Thermo 公司。

1.3 方法

1.3.1 SBSE 的制备及初步分离 SBSE 的制备及初步分离方法参照文献[9]，最终获得试验用SBSE。经测定，10 mg/mL SBSE 溶液中黄酮含量为（2.97±0.31） mg/mL，总酚含量为（4.71±0.21） mg/mL，原花青素含量为（5.67±0.17）mg/mL。

1.3.2 H2O2诱导的B16F10 细胞损伤模型的建立取对数生长期B16F10 细胞以0.05%胰酶消化、细胞培养液制备成单细胞悬液，接种于96 孔细胞培养板中，每孔100 μL，5 000 个细胞。过夜后每孔加入100 μL 含不同浓度样品的培养液或空白对照组培养液。试验设置调零组、细胞对照组、试验组。试验组H2O2的培养质量浓度均设定为15 ～1 500 μg/mL，每组至少6 个平行孔。37 ℃、5% CO2条件下培养4 h。用常规方法加入5 mg/mL MTT溶液与DMEM 混合溶液（体积比1∶5）100 μL 处理4 h，150 μL DMSO 溶解，37 ℃孵育10 min，测定波长490 nm 处的吸光度值。

细胞活力=（试验组-调零组）/（细胞对照组-调零组）×100%

选取IC50值为细胞损伤模型建立条件。

1.3.3 流式细胞术对细胞损伤模型的评价 收集300 μg/mL H2O2处理1，4 h 和6 h 后的细胞样本，每个样品均获取10 000 个细胞。利用Annexin VPE 和7-AAD 对细胞样本进行染色处理，应用CellQuest 软件（Becton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA）进行实验数据的获取和分析。以Annexin V-PE 和7-AAD 荧光作双参数点图，细胞分为4 个区，即Q1：机械损伤细胞（Annexin V-PE-/7-AAD+）；Q2：凋亡晚期或坏死细胞（Annexin V-PE+/7-AAD+）；Q3：早期凋亡细胞 （Annexin V-PE+/7-AAD-）；Q4：活细胞（Annexin V-PE-/7-AAD-）。计算4 群细胞比例并分别对不同处理组进行比较。

1.3.4 MTT 法测定SBSE 对人皮肤成纤维细胞活力的影响 利用MTT 法检测不同浓度SBSE 对B16F10 细胞生命活力的影响。试验组SBSE 的培养质量浓度设定为5.00，1.00，0.50，0.10，0.05 mg/mL，每组至少6 个平行孔。37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。其它步骤同1.3.2 节。

1.3.5 SBSE 对H2O2诱导B16F10 细胞损伤的保护和修复作用 一定浓度的SBSE 作用B16F10细胞24 h，用PBS 清洗2 次，继续用一定浓度的H2O2处理细胞4 h，利用MTT 法检测细胞活力，探讨SBSE 对细胞损伤的保护作用。建立H2O2诱导的B16F10 细胞损伤模型，用一系列浓度的SBSE继续处理细胞24 h，通过MTT 法检测细胞活力，探讨SBSE 对细胞损伤的修复作用。

1.3.6 SBSE 对B16F10 细胞GSH-Px、CAT、SOD及MDA 含量的影响 用300 μg/mL H2O2处理细胞4 h，建立H2O2诱导的细胞损伤模型，随后用0，0.10 mg/mL 或0.40 mg/mL SBSE 继续处理细胞24 h，PBS 清洗，收集细胞。以不经SBSE 处理的细胞为模型对照。

分别用0，0.10 mg/mL 或0.40 mg/mLSBSE 处理细胞24 h，随后用300 μg/mL H2O2处理细胞4 h，PBS 清洗，收集细胞。以不经H2O2处理的细胞为SBSE 对照。

细胞GSH-Px、CAT、SOD 及MDA 含量的测定分别按照GSH-Px、CAT、SOD 及MDA 检测试剂盒说明书进行。

1.4 统计学分析

试验数据用SPSS 19.0 统计软件处理，组间比较采用单因素ANOVA 分析，两两比较采用t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义，所得结果以±s 表示。本试验均设3 组平行。

2 结果与分析

2.1 B16F10 细胞损伤模型的建立及评价

过氧化氢容易在细胞核组织中扩散，导致各种氧化应激产生，因此，在许多研究中都采用外源性过氧化氢处理细胞，诱导细胞氧化损伤和凋亡的产生，从而研究生物活性物质的细胞保护和修复作用[11]。

图1 H2O2 质量浓度对B16F10 细胞活力的影响Fig.1 Effect of concentration of H2O2 on cell viability of B16F10 cells

本试验建立了H2O2诱导的B16F10 细胞损伤模型。首先，利用MTT 法检测不同浓度H2O2对B16F10 细胞的损伤能力。通过探讨1 500～15 μg/mL 质量浓度范围H2O2对B16F10 细胞的活力的影响发现：300 μg/mL H2O2溶液对B16F10 细胞的致损率为（50.31±2.53）%。随着浓度的减少，细胞活力越来越高，当H2O2溶液质量浓度低于150 μg/mL 时，对细胞活力影响不显著（P＞0.05）。利用流式细胞术检测300 μg/mL H2O2不同处理时间对B16F10 细胞凋亡情况的影响（图2）。磷脂结合蛋白Annexin V-PE 是一种标记有荧光素的钙依赖磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）有很强的亲和力，可特异性与PS 结合。正常活细胞带负电的PS 定位于细胞内侧，细胞凋亡早期，由于细胞膜失去对称性，PS 从胞膜的内侧暴露于胞膜外，因此被Annexin V-PE结合称为识别凋亡细胞的标志。坏死细胞PS 也显露于外表使Annexin V-PE 结合成阳性，必须增加7-AAD 参数才能区分坏死细胞。凋亡早期细胞仍保持膜的完整性，7-AAD 不能进入细胞内，而凋亡晚期和发生继发坏死的细胞可同时被Annexin V-PE 和7-AAD 着色[12-13]。本试验中采用的双标记方法可以将凋亡细胞与继发坏死的细胞区分开，并能计算出阳性细胞百分率。对细胞样本做3 次平行处理，流式细胞术结果统计见表1。300 μg/mL H2O2处理B16F10 细胞后，活细胞百分比随着处理时间的延长而显著降低（P＜0.01）。处理4 h 后，活细胞百分比为（49.77±2.74）%；当处理延长到6 h 时，活细胞百分比降低至（28.65±3.15）%。早期凋亡细胞在处理1 h 后未见明显增加，随着处理时间的延长，由对照组的（1.97 ±0.34）%上升到 （17.91 ± 3.55）%（4 h，P＜0.01）和（18.22±0.64）%（6 h，P＜0.01）。此外，H2O2处理也诱导晚期凋亡的发生，处理4 h 后，由对照组的（4.31±0.55）%升至（21.24±2.61）%。继续延长处理时间到6 h，晚期凋亡率达（61.41 ± 1.01）%，约为对照组的14.25 倍。

2.2 SBSE 对H2O2 诱导B16F10 细胞损伤的保护作用

图2 H2O2 诱导B16F10 细胞的凋亡情况Fig.2 Apoptosis of H2O2-induced B16F10 cells

表1 H2O2 诱导B16F10 细胞凋亡的作用（±s，%）Table 1 Apoptosis of H2O2-induced B16F10 cells （±s，%）

表1 H2O2 诱导B16F10 细胞凋亡的作用（±s，%）Table 1 Apoptosis of H2O2-induced B16F10 cells （±s，%）

注：与对照组比较，“*”表示P＜0.05；“**”表示P＜0.01。

?

细胞发生氧化损伤会诱发众多功能性的损失，进而引发组织和机体的衰老及病变。发掘具有保护细胞免受氧化损伤的物质的研究工作越来越得到人们的重视。为探讨SBSE 对细胞损伤的保护作用，本课题组首先利用一系列SBSE 处理B16F10 细胞，随后用300 μg/mL H2O2处理4 h，通过检测细胞活力，分析SBSE 是否对细胞损伤具有保护作用。选择SBSE 的质量浓度范围为0.05～0.40 mg/mL，由图3A 可知，SBSE 单独处理细胞的活力均在60%以上；尽管SBSE 与H2O2双重处理的细胞活力均有所降低，与模型组相比，H2O2诱导0.10 mg/mL SBSE 处理后的B16F10 细胞，其活力还是显著提高（P＜0.01）；SBSE 低于或高于该浓度未表现出对细胞的保护作用，其中，当SBSE 质量浓度过高（0.40 mg/mL）时，反而不利于细胞抵抗H2O2的损伤。以0.10 mg/mL SBSE 处理细胞后，继续进行H2O2处理，细胞活力变化见图3B。与单独SBSE 处理组相比，两种质量浓度H2O2处理（150 μg/mL、300 μg/mL）均使细胞活力显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；然而与单独H2O2处理组（DMEM）相比，SBSE 处理均显著增加细胞活力（P＜0.01，P＜0.01）。

图3 SBSE 保护B16F10 细胞免受H2O2 诱导的氧化损伤Fig.3 The effects of SBSE to protect B16F10 cells away from H2O2-induced oxidative damage

2.3 SBSE 对H2O2 诱导B16F10 细胞损伤模型的修复作用

诸多外因或内因会导致细胞发生氧化应激，在一定程度的氧化应激会帮助机体清除老化细胞，控制或清理变异细胞；当氧化应激水平过高时，会产生大量的自由基，导致细胞或机体受到进一步的损伤。当损伤已然发生，若发掘出某些物质可以干预氧化损伤的继续伤害，减缓或消除对细胞核酸、脂质、蛋白质等大分子物质的破坏，这将具有重要的研究意义。

图4 SBSE 对H2O2 诱导B16F10 氧化损伤模型的修复作用Fig.4 The repair effects of SBSE on H2O2-induced oxidative damage model

本课题组利用一系列浓度SBSE 分别处理H2O2诱导的氧化损伤模型，探讨SBSE 对细胞氧化损伤的修复作用。由图4可知，单独H2O2处理（模型组）后细胞活力为（52.03±8.97）%，在本课题考察SBSE 的浓度范围。0.10 mg/mL SBSE 对损伤细胞具有微弱的修复作用，细胞活力提高至（56.48±2.32）%（P＜0.05）。

2.4 SBSE 对B16F10 细 胞GSH-Px、CAT、SOD 及MDA 含量的影响

细胞的氧化应激伴随着细胞的生长和代谢，机体代谢产生的H2O2只有被不断分解才能维持机体的正常运行。细胞损伤会导致其消除H2O2的能力下降，使活性氧自由基聚集，引起脂质过氧化反应，过氧化产物MDA 大量积累，继而损害蛋白质、脂质等生物大分子。为了维持细胞自身稳态，抗氧化酶系统发挥着非常重要的作用。抗氧化酶GSH-Px 和CAT 是机体内广泛存在的重要的过氧化物分解酶，能够分解机体代谢产生的过氧化氢。SOD 是机体主要的氧自由基（ROS）清除剂，能够清除机体发生氧化应激产生的大量ROS 等自由基。

本课题探讨了不同处理条件下B16F10 细胞的MDA 水平，以及抗氧化酶GSH-Px、CAT、SOD的含量（表2）。由表2可知：与空白对照组相比，0.10 mg/mL SBSE 对照组的GSH-Px 和 SOD 活力无显著变化（P＞0.05），而CAT 水平呈降低趋势（P＜0.05）；增大SBSE 处理浓度（0.40 mg/mL SBSE对照组） 后，GSH-Px、CAT 和SOD 含量均显著降低 （P＜0.01）；SBSE 处理细胞 （0.10 mg/mL SBSE对照组和0.40 mg/mL SBSE 对照组） 后的MDA水平与空白对照组相比，无显著变化（P＞0.05）。

此外，模型组的抗氧化酶GSH-Px、CAT 和SOD 水平显著低于空白对照组（P＜0.01），MDA 含量显著高于空白对照组（P＜0.01），说明H2O2诱导的氧化损伤模型会导致细胞抗氧化酶水平的降低以及脂质过氧化产物MDA 的积累。由表2可知，一定浓度SBSE 的后处理可以增加损伤细胞抗氧化酶的活力，降低MDA 水平的积累。0.10 mg/mL SBSE 处理模型（H2O2-0.10 mg/mL SBSE 处理组）后，GSH-Px、CAT 和SOD 抗氧化酶活力显著高于模型组，分别提高至 （303.06±19.24）mU/mg 蛋白、（107.95±1.29）U/mg 蛋白和（237.27±21.98）U/mg 蛋白；MDA 水平也由模型组的 （14.55 ±0.83）μmol/g 蛋白降为（8.12±0.96）μmol/g 蛋白。0.40 mg/mL SBSE 处理模型细胞的GSH-Px、CAT和SOD 活力随着SBSE 处理浓度的增加而呈降低趋势，MDA 水平高于H2O2-0.10 mg/mL SBSE 处理组。此外，0.10 mg/mL SBSE 的预处理也有助于保护B16F10 细胞免受H2O2诱导的细胞氧化损伤，与模型组相比，SBSE 提高了细胞的抗氧化酶活力，细胞内MDA 的积累也逐渐降低，由（14.55±0.83）μmol/g 蛋白显著降至（11.46±0.92）μmol/g 蛋白（P＜0.05）。

表2 SBSE 对H2O2 诱导B16F10 细胞损伤的修复和保护作用（±s，%）Table 2 The repair and protect effects of SBSE on H2O2-induced oxidative damage cells（±s，%）

表2 SBSE 对H2O2 诱导B16F10 细胞损伤的修复和保护作用（±s，%）Table 2 The repair and protect effects of SBSE on H2O2-induced oxidative damage cells（±s，%）

注：H2O2-0.10 mg/mL SBSE 处理组和H2O2-0.40 mg/mL SBSE 处理组表示H2O2 诱导细胞氧化损伤，随后用0.10 mg/mL SBSE 或0.40 mg/mL SBSE 处理，观察细胞各项指标的变化；0.10 mg/mL SBSE-H2O2 处理组和0.40 mg/mL SBSE-H2O2 处理组表示0.10 mg/mL SBSE 或0.40 mg/mL SBSE 对细胞进行预处理，随后用H2O2 诱导细胞氧化损伤，观察细胞各项指标的变化；与空白对照组比较，“#”表示P＜0.05；“##”表示P＜0.01；与模型组比较，“*”表示P＜0.05；“**”表示P＜0.01。

?

3 讨论

目前，研究抗氧化应激损伤的实验主要有动物实验法、化学测定法和细胞模型法等[14-16]。化学测定法常用的有DPPH 自由基清除法、羟自由基清除法、ABTS 法等。前期研究证实SBSE 具有显著的清除DPPH 和羟自由基的能力[10]。化学测定法虽然快速、简便，但难以模拟机体的复杂内部环境，无法反映抗氧化剂的真实抗氧化机制。细胞模型法更接近于机体内部的复杂环境，更贴切反映抗氧化剂在机体内部的抗氧化机制。不仅如此，细胞实验周期短，更能快速、高效地得出结果。B16F10 细胞为小鼠黑色素瘤细胞，具有增殖快、易于培养等特点，常被用作细胞模型[17-20]。氧化损伤模型主要有H2O2、叔丁基过氧化氢（t-BHP）、D-半乳糖等模型[21-23]。H2O2具有易于取得、操作简便、造模周期短等特点而得到广泛应用[24-26]。

本文通过MTT 法建立了H2O2诱导的氧化损伤模型，确定了H2O2的作用条件为300 μg/mL 刺激4 h，并利用流式细胞术对细胞损伤模型进行评价。为探索SBSE 对氧化损伤模型的保护作用，研究了SBSE 的预处理在防御H2O2诱导的氧化损伤中的作用，结果发现0.10 mg/mL SBSE 的预处理有助于防御H2O2造成的氧化应激损伤，并且，细胞活力随着H2O2处理条件的降低而呈现上升趋势。为探讨SBSE 对损伤模型是否具有修复作用，研究了SBSE 对细胞模型的影响，在考察浓度范围，0.20 mg/mL SBSE 对损伤细胞具有微弱的修复作用，细胞活力提高至（58.19±4.32）%（P＜0.05）。

为进一步明确SBSE 对细胞氧化应激损伤的干预机制，探究了细胞部分抗氧化酶系统以及过氧化产物MDA 积累的情况。在正常情况下，机体氧化与抗氧化处于动态平衡，机体自身的抗氧化酶如SOD、CAT、GSH-Px 等在清除自由基方面发挥重要作用。当外界刺激导致氧化应激损伤，使机体代谢紊乱，无法维持起初的平衡状态时，脂质过氧化导致机体产生大量过氧化产物。MDA 是目前公认能反映氧自由基产生及引发的脂质过氧化反应的间接指标，其含量变化不但可以反映氧自由基生成量及氧化反应的强烈程度，还可反映其对组织损伤的严重程度[27]。张慧芸等[28]在研究丁香多酚的细胞抗氧化水平时发现，丁香多酚可以通过提高SOD、CAT 和GSH-Px 的活力，降低MDA 含量来达到修复受损人肝细胞RBL 的作用。李华[29]在研究虫草多糖的过程中发现，虫草多糖处理用8-甲氧补骨脂素联合紫外线（8-MOP/UVA）制备的皮肤成纤维细胞氧化模型后，能够显著降低自由基含量，且线粒体跨膜电位的破坏程度也有所改善，自由基清除酶系（SOD、CAT 和GSH-Px）活力得到促进。

本试验结果表明，H2O2诱导的氧化损伤会导致细胞抗氧化酶水平的降低以及脂质过氧化产物MDA 的积累；一定浓度SBSE 的后处理可以增加损伤细胞抗氧化酶的活力，以及降低MDA 水平的积累；SBSE 的预处理也有助于提高细胞的抗氧化酶水平，过氧化产物MDA 的积累也逐渐降低。可以断定SBSE 发挥保护及修复氧化应激损伤的机制是通过增加抗氧化酶活力，降低MDA 的积累来实现的。