一种新型苯基四氮唑类化合物的合成及应用研究

池彦伟，汪贞贞

(河南师范大学 化学化工学院，河南 新乡 453007)

吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO-1)是一类存在于机体内的天然免疫调节酶，与同工酶吲哚胺-2,3-双加氧酶2(IDO-2)、色氨酸-2,3-双加氧酶(TDO)共同组成IDO家族。人的IDO1由403个氨基酸残基所组成，相对分子质量约42000，其基因位于8号染色体，长约15kb，包括10个外显子和9个内含子，为单拷贝基因。IDO1广泛分布于肝外组织，主要见于次级淋巴器官和胸腺髓质内，并散布于附睾、胎盘、胃肠道黏膜及眼前房等免疫豁免组织中。IDO1在成纤维细胞、B细胞等多种细胞内均有表达，但是表达量最高的细胞为抗原提呈细胞，如树突细胞核巨噬细胞[1-2]。

IDO1的生理学功能即是通过调节色氨酸及其代谢产物的浓度实现。如：色氨酸耗竭，可(1)抑制致死性免疫排斥反应的发生，(2)抑制细菌、病毒及寄生虫生长，(3)减少蛋白质及5-羟色胺的生物合成，(4)抑制T细胞增殖分化。又如，代谢产生的免疫活性犬尿氨酸可促进免疫反应，维持免疫自稳等[3]。

Muller等研究认为IDO1通过抑制T细胞和自然杀伤细胞的功能在微环境内形成免疫抑制状态，肿瘤细胞可以利用这种负向的免疫调节来逃避免疫系统的识别与杀伤，进而不断发展与转移。IDO1可能通过3种机制参与诱导肿瘤微环境中的免疫耐受。(1)可以抑制SliT细胞增殖：IDO在抗原提呈细胞特别是浆细胞样树突细胞内高度表达，导致细胞局部的色氨酸耗竭，诱导T细胞停滞于G1期，进而抑制T细胞的增殖来下调机体的免疫能力。(2)促进T细胞凋亡：IDO依赖性的色氨酸降解可以导致犬尿氨酸水平提高，进而诱导氧自由基介导T细胞凋亡。(3)树突细胞IDO表达升高，引起局部色氨酸耗竭，进而可以活化和增强调节T细胞的免疫抑制功能，同时抑制效应T细胞的功能，促使机体对肿瘤特异性抗原免疫耐受[4]。

唑类是一类非常重要的含氮杂环化合物，具有多种生物活性，广泛存在于药物分子中。其中，含有四个氮原子的五元芳杂环化合物四氮唑，是羧基的生物电子等排体，可用来取代药物中的羧基以缓解羧基在体内引起的不良反应，且可大大提高药物的脂溶性，进而增加药物的生物利用度。此外，四氮唑类化合物具有抗肿瘤、抗菌、抗疟疾和抗结核菌等多种生物活性，故近年来这类化合物在医药领域的应用越来越广泛，被科学家认为是最具发展前景的一类化合物[5-8]。

综合以上文献及大量实验验证，我们以苯基四氮唑、1,3-二氯丙醇和3,4,5-三甲氧基苯胺为原料，进过一步反应“一锅法“合成了一个新型苯基四氮唑类化合物(图1)，并将该化合物进行了IDO1抑制活性测试。

图1 新型苯基四氮唑化合物的合成路线

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(郑州予华仪器有限公司)；YRE-2020旋转蒸发仪(郑州予华仪器有限公司)；酸度计(梅特勒-托利多)；AV400型核磁共振仪(德国Bruker公司)；LC 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)。

苯基四氮唑(99.5%，阿尔法试剂)；1,3-二氯丙醇(99%，阿拉丁试剂)；3,4,5-三甲氧基苯胺(98%，国药集团)；无水氢氧化钡(99%，国药集团)；其余试剂均为市售分析纯。

1.2 目标化合物的合成

在反应瓶中，把苯基四氮唑15 g(0.1 mol)和无水氢氧化钡34 g(0.2 mol)加入N,N-二甲基甲酰胺200 mL中，在室温条件下搅拌20 min，然后在氮气保护下，缓慢滴加溶有1,3-二氯丙醇13 g(0.1 mol)的N,N-二甲基甲酰胺50 mL，滴加完后室温搅拌反应1 h，然后再缓慢滴加溶有3,4,5-三甲氧基苯胺18 g(0.1 mol)的N,N-二甲基甲酰胺70 mL，缓慢加热至65℃，反应9 h后TLC监控原料反应完全，把反应液倒入水300 mL中，用稀盐酸调节反应液pH值为6，再用乙酸乙酯100 mL萃取反应多次，合并有机相，浓缩后得到目标化合物 35 g，收率为90%；1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)：8.09 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.51 (dd, J1=8.0Hz, J2=8.0Hz, 2H), 6.77 (d, J=4.0Hz, 2H), 4.89 (dd, J1=4.0Hz, J2=8.0Hz, 1H), 4.78 (dd, J1=4.0Hz, J2=4.0Hz, 1H), 4.55(s, 1H), 3.82 (s, 6H), 3.68(s, 3H), 3.57 (d, J=4.0Hz, 1H), 3.39 (t, J1=8.0Hz, J2=8.0Hz, 1H)。

2 结果与讨论

2.1 碱性化合物种类对目标化合物收率的影响

本反应主要进行的是不同结构上的NH与氯代烷的取代反应，因为会生成一分子的HCl，因此需要在碱性环境下进行反应，针对四氮唑环和苯胺的结构不同，如果需要同时发生反应需要对碱性化合物要求比较高，因此我们在其他反应条件不变的前提下对碱性化合物的种类进行了筛选。

表1 碱性化合物的种类对产品收率的影响

由表1可以看出，在其他反应条件不变的前提下，使用氢氧化钡作为该反应的碱性化合物反应效果最好，能够达到90%，主要原因可能是因为相同摩尔数量的氢氧化钡能够提供更多的碱性离子，提高反应液碱性强度，有利于反应的进行。

2.2 反应温度对反应收率的影响

由于苯基四氮唑上面的NH活泼型不是很好，因此在和氯代烷发生取代的时候，需要对反应体系进行加热，进而提高反应物的活化能，反应温度对反应产物收率的影响比较大，因此我们在其他条件下不变的前提下，对反应温度进行了研究。

表2 反应温度对反应收率的影响

由表2可知，在保持其他反应条件不变的前提下，随着反应温度的提高，目标化合物的反应收率逐渐升高，当反应温度达到65℃时，收率达到90%，继续升高温度，反应副产物增多，导致反应收率降低。

2.3 反应时间对反应收率的影响

表3 反应时间对反应收率的影响

由于该反应使用的原料1,3-二氯丙醇，含有活泼的羟基，在碱性环境下如果反应的时间过长，会有副产物出现，因此我们对反应时间进行优化。

由表3可以看出，在保持其他反应条件不变的前提下，随着反应时间的增加，反应收率逐渐提高，当反应时间达到9 h时，反应收率最高达到90%，继续增加反应时间，反应收率降低，因此反应时间9 h为最佳反应时间。

3 IDO1酶活测试

将Hela细胞以每孔40000个细胞的数目铺于96孔细胞培养板中，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养5～6 h，加入稀释好的待测化合物和终浓度为100 ng/mg重组人源干扰素γ激活IDO1表达。细胞于富含5%二氧化碳的37℃细胞培养箱中培养20 h后，用5%三氯乙酸终止反应，并于50℃孵育30 min。细胞培养液经沉淀后，取上清液送LC/MS检测其中的犬尿氨酸含量。根据XLfit5软件进行数据分析，检测到目标化合物IC50为35 μmol/L。

4 结论

本文以苯基四氮唑、1,3-二氯丙醇和3,4,5-三甲氧基苯胺为原料，进过一步反应“一锅法”合成了一个新型苯基四氮唑类化合物，并对合成条件进行了优化筛选，最后发现使用氢氧化钡作为碱性化合物，在65℃条件下反应9 h，能够使反应收率达到90%；最后将该化合物进行了IDO1抑制活性测试，该化合物表现出一定的抑制效果，IC50为35 μmol/L，可为进一步研究提供重要参考。