T₁代转ChIFN-γ基因烟草鉴定及其生长表现

吕赟 李林桦 宋莉 赵德刚

摘 要：雞γ干扰素（ChIFN-γ）是一类具有抗病毒和免疫保护等广泛生物学活性的禽病防治有效药物，通过植物生物反应器表达生产是降低其生产成本和扩大临床应用范围的重要途径。为获得可以利用的ChIFN-γ转基因烟草生物反应器，本文在对T1代转ChIFN-γ基因烟草（TP）进行遗传稳定性检测的基础上，对其株高、叶片、根系及活力等指标进行测定，探讨外源基因表达对受体植物生长发育的影响。结果表明，TP烟草幼苗在移栽后植株较高，生长较快，叶片较多。株高增长以第7 d时最为明显，3个株系的相对生长速度分别为野生型（WT）的253.23%、280.12%和260.42%;TP-1、TP-2和TP-3株系叶片数相对生长速度分别在第28 d、28 d和14 d时达到最大，为WT的117.33%、118.84%和143.79%;在15d时TP株系组培苗的生根数和根系长分别为WT的9.09倍、7.06倍、5.06倍和2.23倍、2.66倍、2.41倍;水培条件下TP株系具有较高的根系活力，以第10 d时最明显，分别为WT的1.12、1.44、1.39倍。因此，转ChIFN-γ基因烟草具有一定的生长优势，未表现出生长抑制现象，研究结果为ChIFN-γ转基因植物生物反应器的进一步应用研究提供了依据。

关键词：ChIFN-γ基因;转基因烟草;生长发育;根系活力

中图分类号：Q786

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2019）02-0075-05     国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.02.013

Abstract：Chicken interferon-gamma （ChIFN-γ） is an effective therapeutic for poultry disease prevention and treatment with broad biological activities such as antiviral and immune protection. Through plant bioreactor expression of ChIFN-γ gene is an important way to reduce its production cost and expand its clinical application range. In order to obtain a usable bioreactor in ChIFN-γ transgenic tobacco， based on the genetic stability test of T1 generation of ChIFN-γ transgenic tobacco （TP）， the height， leaf， root and vigor of the plants were measured to examine the influence of exogenous gene expression on the growth and development of recipient plants. The results showed that TP tobacco seedlings had higher plant height， faster growth rate and more leaves after transplanting. The increase of plant growth rate is most obvious on the 7th day. The relative growth rates of the three TP tobacco lines TP-1， TP-2 and TP - 3 were 253.23%， 280.12% and 260.42% times of the wild type （WT）， respectively. The relative growth rate of leaves reached the maximum at 28 d， 28 d and 14 d for TP - 1， TP - 2 and TP - 3 tobacco lines， respectively， and were 117.33 %， 118.84% and 143.79% times of of the WT. At 15 d， the number of roots for the tissue culture seedlings of the three TP tobacco lines were 9.09， 7.06 and 5.06 times of the WT， respectively， and the root length was 2.23， 2.66 and 2.41 times of the WT， respectively. TP tobacco had higher root activity under hydroponic conditions， which was most obvious on the 10th day， being 1.12， 1.44 and 1.39 times of the WT， respectively. The study indicated that ChIFN-γ transgenic tobacco certainly had growth advantages and showed no growth inhibition. The results provide a basis for the further application of ChIFN-γ transgenic plant bioreactor.

Key words：ChIFN-γ gene; transgenic tobacco; growth and development; root vitality

鸡γ干扰素（Chicken gamma interferon，ChIFN-γ）是由T淋巴细胞经过活化后在诱生剂感化下出现的一类动物细胞因子和巨噬活化因子，不但对DNA和RNA病毒有抑制作用[1]，还具有较强的免疫调节活性，通过调节巨噬细胞、T细胞和B细胞间增强机体免疫功能[2]，在预防和治疗各类家禽病毒性传染病及提高机体免疫机能中具有重要意义。植物是良好的蛋白表达系统，作为生物反应器生产药用蛋白，具有安全有效、成本低廉、蛋白产物活性强等优点[3-4]。自从Cardineau 等[5]报道利用植物生物反应器制备疫苗以来，目前利用植物生物反应器生产药用蛋白已取得长足发展，许多药用蛋白生产已处在临床或上市阶段，如利用胡萝卜生产人干扰素α-2b[6]、红花生产胰岛素、烟草生产乙肝抗体等[7]。本文利用课题组前期获得的T1代转ChIFN-γ基因烟草种子，播种后，对其烟草植株进行生长发育特性研究，为进一步开发利用ChIFN-γ烟草生物反应器和利用动物细胞因子进行植物发育调控提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

转ChIFN-γ基因烟草由贵州大学农业生物工程研究院创制保存，实验材料种植于贵州大学转基因植物试验示范基地。

1.2 转基因植株的GUS染色及PCR鉴定

取T1代转基因烟草（TP）及其野生型亲本（WT）叶片，参照广巧等[8]方法进行GUS组织化学染色和基因组PCR检测。目的基因ChIFN-γ的检测引物序列F：5-CTTTTCCTTGTTTCTGCTAC-3、R：5-ATGGTGGGTCAACAAGCTT-3，1%的琼脂糖凝胶检测反应产物。

1.3 株高和叶片数测定

播种的转ChIFN-γ基因烟草及其野生型亲本幼苗移栽到转基因植物试验示范基地种植，对移栽的3个TP株系及1个WT株系烟草，每隔7 d 测一次株高和叶片数，每个株系测定3株植株。

1.4 根系发育观察

取同一生长时期和部位的TP株系和WT烟草的幼嫩叶片，用75%酒精消毒30 s，无菌水冲洗3～5遍，再用0.1%升汞消毒8 min，无菌水冲洗3～5遍依次灭菌后，分别接种在0.2 mg/L IBA和0 mg/L IBA的生根培养基中后，置于温度为（25±2）℃，光照强度为15000 LX的环境中，按12 h/d光照时间培养15 d。每个株系测3株，重复3次。每天观察和记录烟草根系发育情况。根长用刻度尺（精度为0.1 mm）测量，生根数和根长计算按如下公式计算。

生根数（条）=总根数/接种总株数

平均根长（cm）=总根长/生根总数

1.5 根系活力检测

取相同生长时期和部位的烟草叶片进行离体水培，待叶片生根后第5 d开始取根尖部位进行根系活力检测，每个株系测3株，5天测定1次，共测定3次。测定方法采用氯化三苯基四氮唑法（TTC法）[9]，在含三苯基甲臜（TTF）分别为0.025 mg、0.05 mg、0.10 mg、0.15 mg、0.20 mg标准溶液中，以乙酸乙酯为空白对照，得到其OD485值，绘出标准曲线。根据TTF标准曲线，对不同时期烟草根系活力进行计算，计算公式为：TTC还原强度=TTC还原量（g）/根重（g）·恒温时间（h）。

1.6 数据分析

采用Excel 2010软件计算均值及标准误差，用SPSS Statistics V21软件进行差异显著性分析，用GraphPad Prism 5及Excel 2010绘制图表。

2 结果与分析

2.1 转基因烟草的遗传稳定性

GUS组织化学染色显示，转基因烟草植株的叶片组织呈现明显蓝色，而野生型亲本对照植株未见任何蓝色（图1A）;ChIFN-γ基因的基因组PCR扩增得到约505 bp大小的条带，与目标条带一致，而WT植株则无此带（图1B）。因此，GUS报告基因和外源ChIFN-γ基因均稳定存在于TP植株中，转ChIFN-γ基因烟草具有良好的遗传稳定性。

2.2 转基因烟草的株高和叶片发育情况

对ChIFN-γ基因TP烟草和WT烟草移栽的株高观察发现（图2A），3个TP烟草株系在移栽后7～42 d株高的相对生长速度明显高于WT。其中第7 d时最为显著（P<0.01），3个TP烟草株系植株株高平均相对生长速度分别为1.62%、1.79%、1.67%，依次是WT的253.23%、280.12%和260.42%，TP株系烟草具有较好的生长优势;3个TP烟草株系在14～42 d叶片的平均相对生长速度也明显高于WT（图2B），其中TP-1、TP-2和TP-3株系叶片数的相对生长速度分别在第28 d、28 d和14 d较WT叶片数生长速度达到最大，分别为1.76%、1.78%、1.22%，依次是WT的117.33%、118.84%和143.79%，其中第14 d时TP-3较WT显著（P<0.05）。

2.3 转基因烟草的根系生长发育情况

对烟草进行根系發育统计分析发现（图3，表1），同一时期的TP烟草根系长势普遍比WT烟草好，分支较多且根系长度长。试验期内的TP烟草生根数目均比WT烟草多，无外源IBA时，相同生长阶段的TP-1、TP-2、TP-3株系的平均生根数目分别是3.00条、2.33条、1.67条，分别为WT的9.09倍、7.06倍、5.06倍。在外源IBA（0.2 mg/L）存在的培养基中，3个TP烟草株系的平均生根数目分别是1.67条、1.67条、1.33条，分别是WT烟草5.06倍、5.06倍、4.03倍。相同生长阶段的TP株系烟草具有较高的根系长度，无外源IBA时，3个TP烟草株系的平均长度依次为2.96 cm、3.54 cm、3.21 cm，分别是WT的2.23倍、2.66倍、2.41倍。在有外源IBA（0.2 mg/L）的培养基中，3个TP烟草株系的根系平均长度分别为3.07 cm、2.10 cm、1.63 cm，是WT的3.84倍、2.63倍、2.04倍。可见，ChIFN-γ转基因烟草的根系发育具有一定优势，并且这种优势不受外源IBA的影响。

2.4 转基因烟草的根系活力

取烟草叶片进行水培不定根发育实验，待叶片生根后第5 d开始取根尖部位进行根系活力检测，重复三次。根据标准溶液OD485值分别为0.028、0.056、0.126、0.201、0.294，得到标准曲线如图4，方程式y=0.0015x-0.0179（R.2=0.9942）。

根系活力统计分析表明（表2），TP烟草根系活力普遍比WT烟草的高，在生根后第5d时，TP-1、TP-2和TP-3株系的根系活力依次为1.11 mg/g·h、1.30 mg/g·h、1.59 mg/g·h，分别为WT的1.34、1.57、1.91倍。第10 d时，3个TP株系株系的根系活力依次为1.65 mg/g·h、2.12 mg/g·h、2.04 mg/g·h，分别为WT的1.12、1.44、1.39倍。随着根系不断生长，烟草株系的根系活力逐渐降低，在第15 d时，TP-1、 TP-2和TP-3株系的根系活力依次为0.78 mg/g·h、1.21 mg/g·h、0.98 mg/g·h，分别为WT的1.05、1.63、1.32倍。

3 结论与讨论

受体植物正常的生长发育是转基因生物反应器得到充分利用的基本前提。本文通过研究转ChIFN-γ基因烟草的生长特性以探明该基因表达对受体植物烟草生长发育的影响，为后续利用植物生物反应器生产ChIFN-γ药用蛋白提供理论依据。结果表明，转ChIFN-γ基因的烟草，同WT型比较具有明显的生长发育优势，主要体现在转ChIFN-γ基因的烟草的株高、叶片较WT行高，且具有较好的生长根数和根系长度。同时转ChIFN-γ基因的烟草生长特性可能与其具有较高的根系活力和良好的根系发育有关。

植物的生长发育优势与其生根数和根系长度存在必然联系，有研究表明，根系作为植株养分吸收和运输的主要器官，对植物生长发育起着重要的作用，根系活力则是根系重要的生理指标，不仅影响根系对养分的吸收能力，在某种程度上与植株地上部的生长发育密切相关[10-13]，Kulaeva等[14]用人干扰素处理烟草和小麦后，发现植株根系分裂素活性提高，干扰素表现出促进根系细胞分裂和植物生长发育的作用。当把外源干扰素基因导入受体植物后，也会对植物体的生长发育产生一定影响。Matvieieva等[15]把人的α-干扰素基因导入生菜中，发现转基因生菜的顶端优势被打破，根系分支较多。因此，ChIFN-γ基因能在转基因植物中稳定存在，其表达可促进受体植物的生长发育。研究结果为ChIFN-γ转基因植物生物反应器的进一步应用研究提供了依据。

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