六味地黄丸HPLC指纹图谱建立及主要成分分析

耿丽 蔡云芳

摘要 目的：通過高效液相色谱法（HPLC）对20个不同批次同一厂家的六味地黄丸进行指纹图谱的建立，并对其主要成分进行分析。方法：所有20个批次的六味地黄丸均按照统一方法配制供试品溶液。本研究进样体积为2 μL;色谱柱C18限定窄径为2.1 mm，短柱限定为100 mm，填料粒径限定为1.7 μm，温控箱将色谱柱的温度限定为35 ℃。流动相A的主要由0.01%磷酸和超纯水混合而成;流动相B的主要由乙腈和超纯水混合而成，研究中所有高效液相色谱均采用梯度洗脱程序。前期对HPLC法进行常规的方法学考察，当所有方法学考察均可靠良好时，再对所有批次六味地黄丸进行指纹图谱的建立，然后做进一步的相似度分析和主要成分分析。结果：1）六味地黄丸中主要成分梓醇、马钱苷、山药素Ⅰ均可见良好的分离度，最重要的是这3中成分之间并不存在任何内源性的干扰物质，显示各个成分的专属性均较好。2）对照品线性回归分析结果显示：梓醇对照品回归方程：Y=4 110X+798.99;马钱苷对照品回归方程：Y=4 201X-6.013 4;山药素Ⅰ回归方程：Y=2 632X+115.38。3）梓醇、马钱苷和山药素Ⅰ精密度试验的RSD值分别为0.32%、0.51%、0.27%;稳定性试验RSD值分别为1.98%、2.13%、1.11%;重复性试验RSD值分别为1.35%、1.16%、1.02%;加样回收试验的RSD值分别为2.37%、1.54%、1.93%，均符合当RSD值<3%时，说明采用HPLC这一测定方法是可靠的。4）建立六味地黄丸HPLC指纹图谱后，经过相似度计算，从S1-S20的相似度均大于0.90，说明20个批次的六味地黄丸的样品相似度良好。5）20批不同批次的六味地黄丸中中梓醇、马钱苷和山药素Ⅰ的含量差异无统计学意义，20个不同批次的六味地黄丸中梓醇、马钱苷和山药素Ⅰ的含量的平均值分别为（2.176±0.290）mg/g、（1.875±0.119）mg/g、（1.776±0.095）mg/g。结论：采用HPLC建立六味地黄丸指纹图谱，20个不同批次六味地黄丸经过相似度良好，且各主要成分分析间未见明显差异。

关键词 高效液相色谱法;指纹图谱;六味地黄丸;浓缩丸;梓醇;马钱苷;山药素Ⅰ;主要成分分析

Establishment of HPLC Fingerprint of Liuwei Dihuang Pills and Analysis of Its Main Components

Geng Li1，Cai Yunfang2

Abstract Objective：To establish the fingerprint of Liuwei Dihuang Pills from 20 different batches of the same manufacturer by high performance liquid chromatography（HPLC），and to analyze its main components.Methods：All 20 batches of Liuwei Dihuang Pills were prepared into test solutions according to an unified method.In this study，the injection volume was 2 μL，the narrow diameter of column C18 was 2.1 mm，the short column was 100 mm，the particle size of filler was 1.7 μm，and the temperature of column was 35 ℃ in temperature control box.Mobile phase A was mainly composed of 0.01% phosphoric acid and ultra-pure water，while mobile phase B was mainly composed of acetonitrile and ultra-pure water.Gradient elution procedure was used in all the high performance liquid chromatography studies.Previously，the routine methodology of HPLC was investigated.When all the methodological investigations were reliable and good，the fingerprints of all batches of Liuwei Dihuang Pills were established，and then further similarity analysis and principal component analysis were conducted.Results：1）Catalpol，loganin and batatasin I，the main components of Liuwei Dihuang Pills，showed good resolution.Most importantly，there were no endogenous interfering substances among the 3 components，which showed that the specificity of each component was good.2）Linear regression analysis showed that Catalpol regression equation：Y=4110X+798.99; loganin regression equation：Y=4201X-6.013 4; batatasin I regression equation：Y=2632X+115.38.3）RSD values of catalpol，loganin and batatasin I precision test were 0.32%，0.51% and 0.27%; RSD values of stability test were 1.98%，2.13% and 1.11%; RSD values of repeatability test were 1.35%，1.16% and 1.02%; RSD values of sample addition recovery test were 2.37%，1.54% and 1.93% respectively，which were in line with that when RSD values were less than 3%，thus the determination method of HPLC was reliable.4）After establishing the fingerprint of Liuwei Dihuang Pills by HPLC，the similarity calculated from S1-S20 was greater than 0.90，indicating that the samples of 20 batches of Liuwei Dihuang Pills had good similarity.5）The contents of catalpol，loganin and batatasin I in 20 batches of Liuwei Dihuang Pills had no significant statistical difference.The average values of catalpol，loganin and batatasin I in 20 batches of Liuwei Dihuang Pills were（2.176±0.290）mg/g，（1.875±0.119）mg/g，（1.776±0.095）mg/g，respectively.Conclusion：The fingerprint of Liuwei Dihuang Pills was established by HPLC.The similarity of 20 different batches of Liuwei Dihuang Pills was good，and there was no significant difference among the main components.

Key Words High performance liquid chromatography; Fingerprint; Liuwei Dihuang Pills; Concentrated pills; Catalpol; Loganin; Batatsin I; Main components analysis

中图分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.011

医家钱乙在宋代时期的著书《小儿药证直诀》中记载了滋阴补肾良方——六味地黄丸，而这一仅由熟地黄、山茱萸肉、泽泻、干山药、白茯苓、牡丹皮组成的药方，不仅对头晕耳鸣有疗效，对腰膝酸软等肾阴亏虚的病症也屡见奇效[1-2];现代医学研究更进一步发现六味地黄丸在增强免疫力，改善肾功能等方面的功效[3-5]。而对六味地黄丸的药物质量控制方面，目前的研究较少，有研究者[6-7]从没食子酸、芍药苷等方面入手研究六味地黄丸的质量控制标准;然而没食子酸是山茱萸中含有的成分之一，而芍药苷则是牡丹皮的成分之一，均不是这2种药物的主要成分。《中华人民共和国药典》中明确规定了梓醇作为熟地黄的主要有效成分[8]，马钱苷作为山茱萸的主要有效成分[9]，山药素Ⅰ作为干山药的主要有效成分[10]，由于在六味地黄丸中熟地黄、山茱萸肉和干山药作为本方的君臣药，因此本研究主要成分分析从梓醇、马钱苷和山药素Ⅰ入手，并建立六味地黄丸的HPLC指纹图谱。现具体报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪（美国Agilent安捷伦科技有限公司，型号：1200-LC）;进样器（美国Agilent安捷伦科技有限公司，型号：G1329B）;四元泵（美国Agilent安捷伦科技有限公司，型号：G1311C）;电子版分析天平（河南兄弟仪器有限公司，型号：AS220.R2）;超纯水系统（美国密理博有限公司，型号：Mili-RO Reference）;数字定时超声波清洗器（杭州萧山余祝超声波设备厂，型号：ps—100A）。

1.2 试药 梓醇对照品纯度≥98%（批号：110808-258）和马钱苷对照品纯度≥98%（批号：120801）的药品供应方均是中国食品药品检定研究所;山药素Ⅰ对照品纯度≥98%（批号：51415-00-0）的药品由南京广润生物制品有限公司提供。色谱纯乙腈（美国Fisher公司，批号：102489，）;色谱纯甲醇（南京化学试剂股份有限公司，批号：23612-57-9）。

1.3 分析药品 六味地黄丸（浓缩丸，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，国药准字Z19993068），随机选取20个不同批次的六味地黄丸18070065、18070124、18070003、18070035、18070002、18070025、18070008、18070016、18070057、18070041、18070011、18070064、18070019、18070082、18070111、18070073、18070036、18070029、18070040、18070077分别标识为S1、S2、……S20。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 進样体积为2 μL;色谱柱C18（色谱柱型号：安捷伦ZorbaxSB，产品厂家：美国Agilent安捷伦科技有限公司），本研究的C18柱限定窄径为2.1 mm，短柱限定为100 mm，填料粒径限定为1.7 μm，温控箱将色谱柱的温度限定为35 ℃。流动相A的主要由0.01%磷酸和超纯水混合而成;流动相B的主要由乙腈和超纯水混合而成，研究中所有高效液相色谱洗脱梯度程序均根据表1进行。检测波长通过3D紫外吸收图谱显示在256 nm和274 nm时可以检测到较多的吸收峰。见图1。

2.2 对照品溶液的制备 采用电子分析天平精密分别精密称取梓醇对照品、马钱苷对照品和山药素Ⅰ对照品各5.0 mg，分别放置在用标签标记好3个对照品名的5 mL容量瓶中，并用色谱纯甲醇定容配制成所需浓度，最终得梓醇对照品溶液每毫升含有梓醇0.25 mg;马钱苷对照品溶液每毫升含有马钱苷0.15 mg;山药素Ⅰ对照品溶液每毫升含有山药素Ⅰ0.35 mg。将3种对照品溶液混合摇匀后，即得混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 所有批次的六味地黄丸均按照统一方法配制供试品溶液，具体操作如下：首先采用电子分析天平精密称取六味地黄丸1 g，然后将六味地黄丸在研钵中捣碎成粉末状，将六味地黄丸粉和10 mL甲醇混合如锥形瓶中密闭，并于数字定时超声波清洗器中提取30 min，待冷却后以甲醇补足失重分量，手工摇匀后又在离心机上充分混合10 min，即得六味地黄丸供试品溶液。

2.4 专属性试验 对六味地黄丸供试品溶液和梓醇对照品溶液、马钱苷对照品溶液和山药素Ⅰ对照品溶液进行专属性试验，本研究结果显示，六味地黄丸中主要成分梓醇、马钱苷、山药素Ⅰ均可见良好的分离度，最重要的是这3中成分之间并不存在任何内源性的干扰物质，显示各个成分的专属性均较好。

2.5 线性关系考察 根据对照品溶液配制方法将梓醇对照品溶液、马钱苷对照品溶液和山药素Ⅰ对照品溶液分别根据从高到低的梯度，配制5个浓度梯度的对照品溶液，计算并绘制回归方程，方程中纵坐标Y是各对照品的峰面积，横坐标X是各对照品的浓度，结果显示梓醇对照品溶液、马钱苷对照品溶液和山药素Ⅰ对照品溶液线性关系考察均显示良好。见表2。

2.6 中间精密度试验 取同一批次同一时间配制的六味地黄丸供试品溶液，连续进样6次，检测梓醇、马钱苷和山药素Ⅰ的含量并换算其各自对应的RSD值，结果显示这3个主要成分的RSD值分别为0.32%、0.51%、0.27%，符合当RSD值<3%时，即说明高效液相色谱仪器的精密度良好。见表3。

2.7 稳定性试验 选择同一份六味地黄丸供试品溶液，根据静置时间的从短到长（0、2、4、8、12、24 h）依次检测六味地黄丸中主要成分梓醇、马钱苷和山药素Ⅰ的含量并换算各成分的RSD值，结果显示这3个主要成分的RSD值分别为1.98%、2.13%、1.11%，符合当RSD值<3%时，即说明六味地黄丸供试品溶液在静置24 h内都能保持良好的稳定性。见表4。

2.8 重复性试验 取6份同一批次同一制备方法制备的六味地黄丸供试品溶液，使用同一台高效液相色谱仪器重复测试该供试品溶液，检测六味地黄丸中主要成分梓醇、马钱苷和山药素Ⅰ的含量并换算各成分的RSD值，结果显示这3个主要成分的RSD值分别为1.35%、1.16%、1.02%，符合当RSD值<3%时，即说明六味地黄丸供试品溶液能够保持良好的重复性。见表5。

2.9 回收率试验 在含量已知的六味地黄丸供试品溶液中，加入含量相同的对照品溶液，混合均匀后，对混合液和各个对照品溶液分别重复检测6次，检测六味地黄丸供试品溶液中主要成分梓醇、马钱苷和山药素Ⅰ的含量并换算各成分的RSD值，结果显示这3个主要成分的RSD值分别为2.37%、1.54%、1.93%，符合当RSD值<3%时，即说明采用HPLC法测定六味地黄丸供试品溶液中主要成分的含量是可靠的。

2.10 样品检测结果

2.10.1 六味地黄丸指纹图谱的建立 以S20为参考图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》将其他批次的六味地黄丸样品的色谱峰与S20进行自动匹配，获得16个共有峰，生成六味地黄丸HPLC指纹图谱。经过相似度计算，从S1-S20的相似度分别是0.899、0.961、0.949、0.923、0.936、0.955、0.889、0.978、0.944、0.967、0.926、0.965、0.914、0.961、0.905、0.971、0.988、0.897，如果保留2位小数，所有的样本均大于0.90，说明20个批次的六味地黄丸的样品相似度良好。见图2。

2.10.2 六味地黄丸的主要成分分析结果 20批不同批次的六味地黄丸中主要成分梓醇、马钱苷和山药素Ⅰ的分析结果显示，各个批次中梓醇、马钱苷和山药素Ⅰ的含量差异无统计学意义，20个不同批次的六味地黄丸中梓醇、马钱苷和山药素Ⅰ的含量的平均值分别为（2.176±0.290）mg/g、（1.875±0.119）mg/g、（1.776±0.095）mg/g。见表5。

3 讨论

目前在中药研究的领域中，在研究中药质量控制方面和真伪鉴别方法上，指纹图谱是国内外公認的较好的研究方法[11]。高效液相色谱法（HPLC）因其信息量丰富而在中药指纹图谱研究中被运用最多最广的方法[12-13]，有研究人员采用高效液相指纹图谱法检测六味地黄丸，采用聚类分析法研究发现不同剂型的六味地黄丸存在明显的HPLC指纹图谱差异[14-16];其他研究人员[17-19]进通过系统指纹定量法进一步考察不同剂型六味地黄丸的制作工艺，通过比较六味地黄丸浓缩丸、水蜜丸和胶囊等3种不同剂型，发现从工艺稳定性角度分析，浓缩丸最好，胶囊次之，而水蜜丸最差;而从六味地黄丸所含化学物质差异性角度分析，则浓缩丸最好，水蜜丸次之，而胶囊的差异性最大。尽管研究人员对不同剂型的六味地黄丸做了大量研究，但是对单一剂型的深入研究仍然不多，因此本研究针对工艺稳定性和化学物质差异性最好的六味地黄丸浓缩丸进行深入研究。本研究随机选取20个不同批次同一厂家的六味地黄丸浓缩丸进行HPLC指纹图谱研究，并将其编号S1-S20，以S20为参考图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》将其他批次的六味地黄丸样品的色谱峰与S20进行自动匹配，获得16个共有峰，将生成的六味地黄丸HPLC指纹图谱经过相似度计算，结果显示所有的样本相似度均大于0.90，说明研究中20个批次的六味地黄丸的样品相似度良好。

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（2019-03-19收稿 责任编辑：王明）

基金项目：江苏省预防医学科研课题立项项目（Y2015044）作者简介：耿丽（1976.11—），女，硕士，主管中药师，研究方向：临床中药学，E-mail：249843093@qq.com