补中益气汤联合不同营养方式对肝癌切除术后大鼠免疫功能的影响

宋新梅 马晓勇 曹磊 吴煜龙 郭志学 王颖

摘要 目的：觀察补中益气汤联合不同营养方式对肝癌切除术后大鼠免疫功能的影响。方法：选取45只成功复制肝硬化肝癌并成功用Higgins法行肝部分切除术的大鼠，随机分为常规组、中西结合A组及中西结合B组，每组15只，其中常规组大鼠接受经口进食，中西结合A组采用补中益气汤+肠外营养，中西结合B组采用补充益气汤+肠内营养，连续干预10 d，比较3组大鼠营养指标如血红蛋白（Hb）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白LDL）以及免疫指标如CD3+、CD4+、CD8+、IgG、IgM、IgA表达差异。结果：1）3组大鼠Hb、TC、TG、LDL水平低于正常值，3组中中西结合组高于常规组，其中中西医结合B组较A组升高（P<0.05）。2）3组大鼠治疗前CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、IgG、IgM、IgA、IL-4、IL-6、TNF-ɑ比较，差异无统计学意义（P>0.05），干预后3组以上指标较治疗前均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），中西结合组低于高于常规组，其中中西医结合B组较A组升高，差异有统计学意义（P<0.05），干预后3组CD8+较治疗前显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），中西结合组低于高于常规组，其中中西医结合B组较A组降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：补中益气汤联合肠内营养既可改善肝硬化肝癌术后的营养状况，又可提升其免疫功能。

关键词 肝硬化;肝癌切除术;动物模型;不同营养方式;补中益气汤;营养状况;免疫;机制

Effects of Buzhong Yiqi Decoction Combined with Different Nutritional Methods on Immune Function in Rats after Hepatectomy

Song Xinmei1，Ma Xiaoyong2，Cao Lei1，Wu Yulong1，Guo Zhixue1，Wang Ying1

Abstract Objective：To observe effects of Buzhong Yiqi Decoction combined with different nutritional methods on immune function in rats after hepatectomy.Methods：Forty-five rats with successfully duplicated cirrhotic hepatoma and successful hepatectomy by Higgins method were included in the study.They were randomly divided into routine group，integrated Chinese and western group A and integrated Chinese and western group B，with 15 rats in each group.The routine group received oral feeding，the integrated Chinese and western group A was used Buzhong Yiqi Decoction+ parenteral nutrition，and the integrated Chinese and western group B was treated with Buzhong Yiqi Decoction+ enteral nutrition.They were intervened continuously for 10 d.Expression differences of nutritional indexes[hemoglobin（Hb），total cholesterol（TC），triglyceride（TG）and low density lipoprotein（LDL）]and immune indexes（CD3+，CD4+，CD8+，IgG，IgM and IgA）were compared among the groups.Results：1）The levels of Hb，TC，TG and LDL in the 3 groups were lower than the normal values.Among the 3 groups，those in the integrated Chinese and western groups were higher than those in the routine group，and those in the integrated Chinese and western group B were higher than those in the group A（P<0.05）.2）There was no significant difference in the CD3+，CD4+，CD4+/CD8+，IgG，IgM，IgA，IL-4，IL-6 and TNF-α among the 3 groups before the treatment（P>0.05）.After the intervention，the above indicators in the 3 groups were significantly lower than those before the treatment（P<0.05）.Those in the integrated Chinese and western groups were lower than those in the routine group，and those in the integrated Chinese and western group B were higher than those in the group A（P<0.05）.After the intervention，the CD8+ in the 3 groups was increased significantly compared with that before the treatment（P<0.05）.That in the integrated Chinese and western groups was lower than that in the routine group，and that in the integrated Chinese and western group B was lower than that in the group A（P<0.05）.Conclusion：Buzhong Yiqi Decoction combined with enteral nutrition can improve nutritional status and immune function of cirrhotic hepatoma patients after operation.

Key Words Liver cirrhosis; Hepatectomy; Animal model; Different nutritional methods; Buzhong Yiqi Decoction; Nutritional status; Immunity; Mechanism

中图分类号：R289.4;R735.7文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.016

肝硬化、肝癌机体均存在肝代谢功能障碍，机体发生营养不良的风险极大，而肝硬化合并肝癌的患者尤为明显[1-2]。目前手术切除是治疗肝硬化肝癌的有效治疗方案，但术后常因营养不良或机体免疫功能紊乱而出现肝衰竭或复发等，故我们认为加强肝硬化肝癌术后营养，提升机体免疫功能具有重要的临床意义。补中益气汤首载金元时期医学家李杲之《内外伤辨惑论》，具有补中益气、升阳举陷之功。临床不乏其有效促进患者免疫功能的报道[3-5]，但其作用机制目前尚无统一定论，此外，补中益气汤与何种营养摄入方式结合更有利于提高机体免疫及营养状况，目前尚不可知。基于此，我们将肝硬化肝癌切除术后大鼠作为研究对象，结合不同营养方式，探讨其疗效及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

选取45只清洁级雄性SD大鼠纳入研究，均购自济南金丰动物实验有限公司（许可证号：SCXK（鲁）20140006），鼠龄3～4个月，平均鼠龄（3.22±0.28）个月，体质量230～250 g，平均体质量（241.00±4.21）g。饲养条件：温度（25±0.5）℃，湿度（50±1.5）%，12 h/12 h晝夜交替。3组大鼠在鼠龄、体质量等差异无统计学意义（P>0.05）。具有可比性。本研究实验过程中动物的处理均严格按照国际道德准则和国家健康指南关于维护和使用实验动物先关条例进行。

1.1.2 药物

补中益气汤由本院中药研究院提供，中药组成：黄芪18 g、甘草9 g、人参6 g、当归3 g、橘皮6 g、升麻6 g、柴胡6 g、白术9 g。

1.1.3 试剂与仪器

大鼠血红蛋白（Hb）试剂盒（购自博士康生物有限公司，编号230924145）、总胆固醇（TC）试剂盒（购自上海酶联生物科技有限公司，编号39283928）、三酰甘油（TG）试剂盒（购自博士康生物有限公司，编号232208823）、低密度脂蛋白（LDL）试剂盒（购自上海邦奕商贸有限公司，编号8328823）。大鼠IgM试剂盒（购自上海西唐生物有限公司，编号F15770）、大鼠IgG试剂盒（购自上海西唐生物有限公司，编号F15760）、大鼠IgA试剂盒（购自上海西唐生物有限公司，编号F1574）。大鼠IL-4试剂盒（购自上海邦奕商贸有限公司，编号8281823）、IL-6试剂盒（购自上海邦奕商贸有限公司，编号8311823）、TNF-ɑ试剂盒（购自上海邦奕商贸有限公司，编号892833）;营养液（瑞代，华瑞制药有限公司，编号：140297），显微剪刀、显微镊、手术刀（均购自上海医疗器械有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

选取45只SD大鼠并成功制备肝硬化肝癌大鼠模型，并接受按Higgins法切除带瘤的大鼠肝中叶。将45只大鼠随机分为常规组、中西结合A组及中西结合B组，每组15只。

1.2.2 给药方法

常规组大鼠予常规经口进食，普通饲料及自由饮水;中西结合A组采用补中益气汤联合肠外营养，按大鼠与人体间等效剂量换算将补中益气汤制备成0.66 g/mL药液，每日灌胃1次，同时予以恒流微泵持续输注静脉营养液，连续干预10 d;中西结合B组采用补中益气汤联合肠内营养，按大鼠与人体间等效剂量换算将补中益气汤制备成0.66 g/mL药液，每日灌胃1次，同时予以营养液灌胃，热量及含氮量同中西结合A组，连续干预10 d。

1.2.3 检测指标与方法

Hb、TC、TG、LDL、IgM、IgA、IgG、IL-4、IL-6、TNF-ɑ检测：干预结束后取各组大鼠尾缘静脉血5 mL，使用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测，利用抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合原理进行相关因子浓度的检测。具体步骤如下：用0.05 mol/L pH值9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10 μg/mL。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1 mL，4 ℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，3 min/次。加一定稀释的待检样品0.1 mL于上述已包被之反应孔中，置37 ℃孵育1 h。然后洗涤。同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔。随后在各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1 mL。37 ℃孵育0.5～1 h，洗涤。再于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1 mL，37 ℃10～30 min。于各反应孔中加入2 mol/L的硫酸溶液0.05 mL。试剂盒由广州达安基因股份有限公司提供，显色后采用492 nm波长，TMB反应产物检测需要450 nm波长。检测时一定要首先进行空白孔系统调零，用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值（P/N）表示。以空白对照孔调零后测各孔A值，若大于规定的阴性对照A值的2.1倍，即为阳性。操作过程全部按照试剂盒说明书进行检测。

流式细胞检测法T淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD8+）测定：干预结束后取各组大鼠尾缘静脉血5 mL，提取外周血单核细胞（PBMC，1×106/mL）200 μL，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，加入刺激剂佛波醇乙酯（PMA）及离子霉素、莫能霉素等工作液并混匀，置于37 ℃，5%CO2。培养箱中培养4～6 h。用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，离心收集细胞，加人5 μL异硫氰酸荧光素标记的CD3+、CD4+、CD8+，操作按试剂盒说明书进行。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行研究数据的统计分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两样本t检验或两样本秩和检验;组内比较采用配对t检验或配对秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组Hb、TC、TG、LDL比较

3组大鼠Hb、TC、TG、LDL水平均低于正常值，中西结合组高于常规组，中西医结合B组较A组升高（P<0.05）。见表1。

2.2 3組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、IgG、IgM、IgA、IL-4、IL-6、TNF-ɑ比较

3组大鼠干预前CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、IgG、IgM、IgA、IL-4、IL-6、TNF-ɑ比较，差异无统计学意义（P>0.05），干预后3组以上指标较治疗前均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），中西结合组低于高于常规组，其中中西医结合B组较A组升高，差异有统计学意义（P<0.05），干预后3组CD8+较治疗前均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），中西结合组低于高于常规组，其中中西医结合B组较A组降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2～4。

3 讨论

据目前临床资料显示肝硬化、肝癌患者多数合并营养不良及免疫系统紊乱，早期营养支持可有效促进患者病情恢复已被证实[7-9]，目前临床营养支持方式包括肠内营养及肠外营养。本研究结果显示补中益气汤结合肠内营养方式更可提高肝硬化肝癌切除术后机体的免疫功能，改善营养状况。补中益气汤首载金元时期医学家李杲之《内外伤辨惑论》，是益气健脾之经典名方。方中黄芪为君药，入脾肺两经，有补中益气、升阳固表之功;人参、甘草、白术合用，共奏补气健脾，为臣药;君臣合用，可增强黄芪补益中气之功，血为气之母，癌症患者病情日久伤津耗气，加之手术二次损伤，更加气虚之证，气虚日久，营血亦亏，故加当归养血和营，协人参、黄芪以补气养血;陈皮理气和胃，使诸药补而不滞，共为佐药[10-12]。方中加少量的升麻、柴胡升阳举陷，协助君药以提升中气，《本草纲目》云：“升高引阳明之清气上升，柴胡引少阳清气上升，此乃禀赋虚弱，元气虚馁，及劳役饥饱，生冷内伤，脾胃引经最要药也”。诸药合用，使气虚得补，病体得安。研究证实，补中益气汤可明显提高重症患者的营养状态，促进病情恢复[13]。

机体的T淋巴细胞及B淋巴细胞是免疫系统的重要组成部分，二者相互协调、相互作用，共同调控机体的免疫。CD3+、CD4+、CD8+是T淋巴细胞亚群重要成员，参与机体的细胞免疫调节，其中CD4+可有效提升机体抗肿瘤效应，CD8+是机体发挥免疫抑制的关键，CD4+/CD8+是可客观体现肝癌术后患者免疫抑制程度的高低[14-16]。B淋巴细胞参与的是机体的体液免疫，IgA、IgM、IgG是B淋巴细胞重要成员[17-18]。机体的单核巨噬细胞系统及内皮细胞均可分泌TNF-α，从而参与机体多种生物活性反应，其中最显著的是免疫调节，TNF-α广泛参与机体免疫系统的多个环节;IL-4及IL-6是机体重要的炎性反应递质，与TNF-α均是机体重要的免疫细胞因子，是免疫调控的主要执行者[19-20]。本研究结果显示肝硬化肝癌模型大鼠接受Higgins法切除瘤体后免疫功能出现紊乱，3组大鼠治疗前CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、IgG、IgM、IgA、IL-4、IL-6、TNF-ɑ比较，差异无统计学意义（P>0.05），干预后3组以上指标较治疗前均显著降低（P<0.05），中西结合组低于高于常规组，其中中西医结合B组较A组升高（P<0.05），干预后3组CD8+较治疗前均显著升高（P<0.05），中西结合组低于高于常规组，其中中西医结合B组较A组降低（P<0.05）。这一结果充分说明了补中益气汤联合营养支持确可明显改善肝硬化肝癌术后大鼠的免疫功能，改善其营养状态，其中补中益气汤结合肠内营养方式疗效更优。

经过实验研究证实补中益气汤联合肠内营养即可改善肝硬化肝癌术后的营养状况，又可提升其免疫功能。

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（2018-12-29收稿 责任编辑：杨觉雄）

基金项目：河北省卫生厅科研基金项目（07269）作者简介：宋新梅（1977.05—），女，本科，副主任医师，研究方向：临床营养学，E-mail：2069638754@qq.com通信作者：马晓勇（1976.10—），男，硕士，副主任医师，研究方向：骨科疾病的治疗，E-mail：811423587@qq.com