冰温保鲜过程中鸡肉品质及微观结构的变化

李莎莎，计红芳,*，张令文，武胜龙，韩西平，陈复生，马汉军

1(河南科技学院 食品学院，河南 新乡，453003) 2(河南工业大学食品科学与工程博士后流动站，河南 郑州，450001)

冰温保鲜是将食品置于 0 ℃以下，冰点以上温度区域(冰温带)内进行贮藏[1]。冰温贮藏可以抑制酶的活性与微生物繁殖，从而最大限度地保持食品新鲜度，减少汁液流失，减缓蛋白变性，延长食品货架期，被认为是继冷藏与气调保鲜之后的第三代保鲜技术[2]。近年来，已有学者研究了冰温贮藏对鸡肉品质与货架期的影响[3-4]。葛庆联等、邵磊等研究表明，冰温保鲜能很好地控制鸡肉菌落总数和TVB-N，延缓pH值升高，可将保鲜期延长至10 d左右[5-6]。许立兴等研究发现，鸡肉在-1 ℃贮藏至18 d时，细菌总数、TVB-N、pH均符合国家二级鲜肉标准。-1 ℃冰温较4 ℃冷藏能更好地延缓鸡肉腐败变质，使保鲜期延长13 d[7]。CLAVSSEN等根据菌落总数及其质量限量标准(<1×107CFU/g)的结果，证实冰温鸡肉的货架期比冷藏条件能延长50%[8]。然而，鸡肉在冰温贮藏期间品质及理化性质的变化都与内部水分活动状态与迁移情况有关。此外，冰温贮藏期间，鸡肉组织结构的变化情况，也鲜有报道。低场核磁共振(low field nuclear magnetic resonance, LF-NMR)是一种快速无损的光谱检测手段，多数以氢核为研究对象来检测肉品中氢原子核在磁场中弛豫特征，进而获取肉品水分分布信息，是国际上在微观层面用于研究肉品中水分状态及分布情况的先进技术[9]。扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)可直接利用样品表面材料物质性能进行微观成像，也是一种微观形貌观察的常用手段。因此，本文以4 ℃冷藏为对照，研究鸡肉在-1.5 ℃冰温贮藏过程中鸡肉品质的变化，以及水分分布状态与迁移、微观结构的变化等，以期为延长鸡肉保鲜期、开发新型鸡肉保鲜方式提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白羽鸡日龄 40～45 d，体重约(1.6±0.12)kg，购于河南省新乡市洪门菜市场。宰杀前12～24 h停止喂食，仅喂水，宰杀后20 min内迅速进入无菌室，4 ℃ 环境下对鸡肉进行无菌分割，取鸡胸肉，每份200 g左右装入保鲜袋，排出袋内空气再装入自封袋，分别放入4 ℃、-1.5 ℃贮藏，隔天取样，测各项指标。

1，1,3,3-四乙氧基丙烷、三氯甲烷、三氯乙酸、乙二胺四乙酸二钠、2-硫代巴比妥酸、MgO、H3BO3、HCl、无水乙醇、平板计数琼脂培养基、NaCl、25%戊二醛，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

YP5002电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司；DZKW-4恒温水浴锅，北京中兴伟业仪器有限公司；TGL-15B高速离心机，上海安亭科学仪器厂；AD200L-P型分散均质机，上海昂尼仪器仪表有限公司； WFJ 7200型紫外可见分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；TA-XT plus质构仪，英国Stable Micro Systems公司；SPX-150-C恒温恒湿培养箱，上海琅玕实验设备有限公司；CR-400色差仪，日本Konica Minolta公司；Quanta 200扫描电子显微镜，美国FEI公司；PQ001台式NMR分析仪，上海纽迈电子有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 色泽的测定

采用CR-400精密色差仪，以标准白板作为对照进行样品色差测定，每组随机取3块平行样品，每块样品在固定的某一表面随机选取3个点测定，记录L*、a*和b*值，分别为亮度指数、红度指数和黄度指数[10]。

1.3.2 持水性的测定

参照许立兴等法[7],计算如公式(1)。

(1)

式中：m，由样贮存前质量；m2，由样贮存后蒸煮离心后质量。

1.3.3 硬度与弹性的测定

参照ZHOU等法并稍作修改[11]。采用TA-XT plus质构仪对样品(Φ2 cm×2 cm)进行测试，使用直径为50 mm的圆柱形探头(P50)，参数如下：测试前速、测试速度、测后速度均为2 mm/s，压缩样品高度为40%，时间5 s，触发类型为自动，触发力20 g。相关参数为硬度、弹性。每组样品测定10次求平均值。

1.3.4 TBA值的测定

参照向雅芳等法并稍作修改[12]。取捣碎的鸡肉10 g，加50 mL 75 g/L的三氯乙酸混合液，均质，双层滤纸过滤，取滤液5 mL加5 mL TBA混匀加塞，90 ℃水浴40 min，冷却1 h加5 mL三氯甲烷，摇匀静置分层，上清液532 nm测吸光度。如式(2)所示。

(2)

式中：m1，丙二醛质量，mg；m2，样品质量，kg。

1.3.5 TVB-N值的测定

参照《GB 5009.228—2016 食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》[13]。

1.3.6 菌落总数的测定

参照《GB 4789.2—2016 食品安全国家标准食品微生物学检测菌落总数测定》[14]。

1.3.7 NMR自旋-自旋驰豫时间(T2)的测定

参考邵俊花等法并稍做改动[15]。质子共振频率22 MHz，测量温度32 ℃。将约2 g样品放入直径为15 mm核磁管中。T2用CPMG序列进行测量。参数：η值(90°脉冲和180°脉冲之间时间)为200 μs，重复扫描32次，间隔时间为110 ms，得到12 000个回波。每组样品测定5次求平均值。

1.3.8 微观结构的测定

将肉样垂直肌纤维方向切成小块(3 mm×3 mm×3 mm)，用质量浓度为25 g/L的戊二醛(pH 6.8)浸泡，过夜固定。先用0.1 mol/L pH 6.8的磷酸缓冲液洗3次， 每次10 min。然后分别使用体积分数50%～90%的乙醇脱水，每次10 min，再用无水乙醇进行脱水，每次10 min， 共 3次。最后，采用氯仿进行脱脂1 h，再用无水乙醇与叔丁醇混合液(V(无水乙醇)∶V(叔丁醇)=1∶1)以及叔丁醇各进行1次置换，每次为15 min。真空干燥后进行扫描观察[16]。

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 鸡肉在贮藏过程中色泽的变化

由表1可知，-1.5 ℃贮藏的20 d内，鸡肉L*值在51.66～54.09，变化趋势相对比较稳定，但整体高于4 ℃贮藏的L*值。4 ℃贮藏L*值的变化趋势波动较大，大体呈先升高后下降趋势，4 ℃贮藏4 d鸡肉的L*值上升至最高，为57.77，是-1.5 ℃贮藏4 d的1.09倍。这可能是因为随贮藏时间的延长，鸡肉的肌纤维结构逐渐遭到破环，蛋白网络结构收缩，与蛋白质结合的水游离出来，水分积于鸡肉表面，导致对光的反射能力增强[17]。4 ℃贮藏6 d时L*值为51.22，显著下降(P<0.05)，这可能是因为发生了脂肪氧化和色素降解反应等，使鸡肉表面颜色发暗[18]，或者是肌红蛋白与氧气结合生成褐色的高铁肌红蛋白，导致贮藏后期L*值下降，与刘茵茵等[19]研究结果基本一致。

鸡肉在-1.5 ℃和4 ℃贮藏期间，a*值变化趋势大体相似，均呈先升高后降低趋势，且4 ℃条件下的a*值高于-1.5 ℃。贮藏前期，鸡肉中的肌红蛋白与包装袋中残留少量氧气结合生成鲜红色不稳定的氧合肌红蛋白，从而使a*值增大[7]；随贮藏时间延长，脂肪氧化产生的自由基破坏了高铁肌红蛋白还原酶，导致高铁肌红蛋白增多，鸡肉从鲜红色变为褐色，a*值变小[7]。-1.5 ℃和4 ℃贮藏期间鸡肉的b*值变化趋势和a*值变化趋势相类似。

表1 4 ℃和-1.5 ℃贮藏过程中鸡肉色泽、硬度和弹性的变化Table 1 Change in color, hardness and springiness of chicken during stored at 4 ℃ and -1.5 ℃

注：大写字母表示4 ℃条件下指标差异显著性(P<0.05)；小写字母表示-1.5 ℃条件下指标差异显著性(P<0.05)。

2.2 鸡肉在贮藏过程中持水性的变化

由图1可知，随贮藏时间的延长，-1.5 ℃和4 ℃ 条件下鸡肉持水性呈下降趋势，且-1.5 ℃的持水性明显高于4 ℃。4 ℃贮藏8 d的鸡肉持水性与贮藏0 d的相比下降了7.06%，而-1.5 ℃贮藏14 d下降了7.36%，16 d下降了10.21%。OLSSON等报道了蛋白水解可造成细胞结构松散，使细胞内水分向细胞外扩散，汁液流失率增加，同时细菌产生的酶也能加大蛋白水解程度[20]。随贮藏时间的延长，微生物的迅速增殖进一步加快了蛋白水解与细胞破坏的速度，汁液流失率升高，使鸡肉的持水能力下降[21]。低温能够抑制微生物生长，因此与4 ℃相比，-1.5 ℃贮藏鸡肉的持水性下降相对较为缓慢。

图1 贮藏过程中鸡肉持水性变化Fig.1 Changes in water holding capacity of chicken during storage

2.3 鸡肉在贮藏过程中硬度与弹性的变化

由表1可知，在贮藏过程中鸡肉的硬度总体呈先降低后升高再下降趋势。4 ℃和-1.5 ℃均在贮藏第2天开始下降，造成这种现象的原因，可能是肉的成熟过程导致肌原纤维的肌动蛋白被分离，包围在每个肌原纤维周围的肌质网状结构崩溃，可溶性肌浆蛋白大部分被分解，成熟期间肉的嫩度增加，硬度下降[22]；第4天达到最大值，分别为4 ℃与-1.5 ℃的4 197 g、4 541 g，随后下降，可能是由于肌肉在内源性蛋白酶和微生物的作用下，肌原纤维结构变得松软[23]，致使鸡肉硬度降低，但-1.5 ℃贮藏鸡肉的硬度始终高于4 ℃贮藏的鸡肉硬度。

弹性反映一定时间内恢复形变的能力。鸡肉的弹性随时间的延长呈下降趋势，且-1.5 ℃明显高于4 ℃。4 ℃条件下鸡肉弹性在第4天以后降幅较大(P<0.05)，贮藏第8天与贮藏0 d的弹性相比，下降了10.06%；-1.5 ℃贮藏前期鸡肉弹性下降较为缓慢，第16天后急速下降(P<0.05)，贮藏第18天与贮藏0 d的弹性相比下降了10.8%。可见，冰温贮藏可以良好保持鸡肉的硬度与弹性。

2.4 鸡肉在贮藏过程中TBA值的变化

TBA值可以用来反映肉类脂肪的氧化程度，TBA值越大，说明脂肪的氧化程度越高，酸败也就越严重[24]。如图2所示，鸡肉在贮藏过程中TBA值呈上升趋势，且4 ℃明显高于-1.5 ℃。在贮藏第8天时，4 ℃和-1.5 ℃的TBA值分别为贮藏0 d鸡肉的2.96、2.52倍，可能是因为贮藏期间肉中的脂肪与袋中的氧气结合发生氧化酸败，脂质氧化产生的二级产物显著升高，致使TBA值升高。SRINIVASAN等认为，脂肪氧化程度的迅速增加可能与细胞释放的氧化酶和促氧化剂有关[25]。-1.5 ℃贮藏12～20 d鸡肉的TBA值趋于平稳(P>0.05)，可能是因为随着贮藏时间的延长，袋内的氧气逐渐消耗殆尽，脂肪酸败反应减弱。冰温贮藏可以延缓鸡肉的脂质氧化，延长保质期。

图2 贮藏过程中鸡肉TBA值的变化Fig.2 Changes in TBA of chicken during storage

2.5 鸡肉在贮藏过程中TVB-N值的变化

TVB-N值已经被世界上很多国家认定为肉及肉制品腐败变质的有效指标，它是指动物性食品在贮藏过程中，由于肌肉中内源酶和细菌共同作用，蛋白被分解而产生的氨及胺类等碱性含氮物质，含量越高，蛋白分解变质越严重[5]。由图3可知，随贮藏时间的延长，TVB-N值呈上升趋势，4 ℃贮藏4 d，TVB-N值达到16.55 mg/100 g，已超出一级鲜度标准(<15 mg/100 g)， 8 d时达到25.5 mg/100 g，明显超出变质肉国家标准(>25 mg/100 g)； -1.5 ℃在2～14 d上升较为缓慢，第14天时达到14.96 mg/100 g，仍属于一级鲜度范围内，之后上升，第16天达到20.32 mg/100 g， 仍属于二级鲜度(≤25 mg/100 g)，第18天达到25.21 mg/100 g，轻微变质。这是由于贮藏期间，微生物在营养丰富的鸡肉上迅速生长繁殖，同时由于酶的共同作用，肉中蛋白质被分解，产生氨及胺类等碱性含氮物质，并产生不愉快气味，从而使鲜度大大降低[26]。可见，鸡肉在4 ℃贮藏第6天时开始腐败变质，而-1.5 ℃第18天 开始腐败变质，表明冰温贮藏能更好地保持鸡肉的新鲜度，与冷藏相比，可使鸡肉的贮藏期延长12 d左右。周梁等在研究猪肉冰温贮藏过程中品质变化时发现，4 ℃贮藏条件下猪肉的TVB-N值在第7天时达到了20 mg/100 g，而冰温处理第21天 TVB-N值仅为15 mg/100 g[27]。许立兴等研究发现，-1 ℃条件下贮藏鸡肉的TVB-N含量要远远小于4 ℃贮藏鸡肉的TVB-N含量[7]，与本研究结果相一致。

图3 贮藏过程中鸡肉TVB-N值的变化Fig.3 Changes in TVB-N Values of chicken during storage

2.6 鸡肉在贮藏过程中菌落总数的变化

由图4可知，冷藏和冰温条件下鸡肉的菌落总数均呈先降低后升高的趋势。4 ℃贮藏4 d菌落总数为7×104CFU/g，第6天时菌落总数为5×106CFU/g，已超过国家标准规定的鲜度范围(≤106CFU/g)；-1.5 ℃贮藏菌落总数增加缓慢，第16天时菌落总数为3.8×105CFU/g， 第18 天时菌落总数为1.5×106CFU/g，刚有变质迹象。可能是因为鸡肉在屠宰、分割和包装等过程中携带少量微生物，低温环境能抑制微生物生长，菌落总数下降。随贮藏时间的延长，鸡肉组织松软内容物渗出，为微生物生长提供了有利的营养条件，菌落总数快速增长。可见，冰温贮藏能够明显抑制微生物生长繁殖，延长其货架期[4]。邵磊等研究得出4 ℃与-1 ℃贮藏期间鸡脯肉菌落总数的变化规律[6]，与本文类似。

图4 贮藏过程中鸡肉菌落总数的变化Fig.4 Changes in total bacterial count of chicken during storage

2.7 鸡肉在贮藏过程中水分迁移特性的变化

鸡肉在4 ℃与-1.5 ℃贮藏条件下的水分迁移变化，可通过质子NMR测量自旋-自旋弛豫时间(T2)来反映。T2反映了样品内部氢质子所处的化学环境，例如氢质子所受的束缚力及自由度，与样品的内部结构紧密相关[28]。结合水弛豫时间在0～10 ms，表征与大分子如蛋白等紧密结合的水，用T2b表示；T21和T22弛豫时间分别在10～100 ms和100～1 000 ms，表示不易流动水和游离水，即肌纤维与膜之间不易流动水和细胞外间隙能自由流动的水[29]。由表2与表3可知，本试验出现3个特征峰，即T2b、T21和T22，随贮藏时间的增加，4 ℃与-1.5 ℃贮藏的T2b、T21、T22均呈现出峰值向较长时间方向移动的趋势。T2越短，表明水与底物结合越紧密，T2越长，表明水分越自由[30]。弛豫时间的延长表示鸡肉在贮藏过程中水分流动性增强，不易流动水逐渐向自由水转化，这可能与鸡肉品质不断下降有关。对比2种贮藏温度下T2各峰弛豫时间的大小与变化速率可以发现，-1.5 ℃贮藏条件下鸡肉的T2弛豫时间相对较短且变化缓慢。根据T2弛豫峰的积分面积可以估算氢质子相对含量，因此水分含量的变化情况可用T2弛豫峰积分面积百分比来表示[31]。随贮藏时间的增加，2种贮藏温度下的P2b始终在0.5%～0.7%，且差异不显著(P>0.05)，表明结合水在鸡肉体系中所占百分比极小，不是鸡肉水分主要的存在形态。4 ℃与-1.5 ℃贮藏温度下的P21持续下降，分别从84.17%下降到8 d 的68.16%与20 d的68.47%，而P22持续增加，分别从15.16%上升到8 d的31.36%与20 d的31.04%， 鸡肉自由水含量的增加，直接导致了其保水性的下降。相对于4 ℃冷藏，-1.5 ℃冰温贮藏可以更好维持鸡肉的保水能力。朱丹实等研究了冰温及冷藏对鲤鱼水分迁移的影响，结果表明，相对于-2， 4 ℃贮藏下鲤鱼肌肉内部水分迁移更为剧烈[9]。

表2 4 ℃贮藏鸡肉T2弛豫时间与峰面积百分比的变化趋势Table 2 Change trendin T2 and peak area percentage of chicken stored at 4 ℃

注：同一列中不同小写字母表示差异显著(P< 0.05)。

注：同一列中不同小写字母表示差异显著(P< 0.05)。

2.8 鸡肉在贮藏过程中微观结构的变化

由图5可知，新鲜鸡肉横切面细胞大小均匀，结构完整，相互间缝隙均匀一致。4 ℃贮藏6 d时细胞骨架蛋白内结缔组织开始降解，肌原纤维结构部分模糊，细胞排列不整齐，肌原纤维的扭曲和收缩可能是由于失水以及蛋白酶的降解引起[32]，贮藏8 d时细胞间隙变大，肌内膜、肌束膜等肌原纤维内部结缔组织严重降解导致肌原纤维与肌节分离[33]；冰温贮藏前期鸡肉组织形态完整，与贮藏0 d的鸡肉相比，变化不大。贮藏18 d时细胞间结缔组织开始降解，细胞间隙部分变大，到第20天肌原纤维结构模糊，细胞排列不整齐。FUKUMA等研究南非大鲭、比目鱼、红海鲷鱼在低温保鲜时发现，在保藏2 d后肌肉内部构成肌原纤维间结缔组织的胶原蛋白开始降解，从而导致肌原纤维间的分离[34]。李侠等研究发现，猪肉贮藏过程中肌节逐渐崩解并且发生收缩现象，肌纤维结构的收缩将细胞内的水分“挤出”，自由水含量增加，肌肉的保水性下降[35]。

图5 贮藏过程中鸡肉微观结构的变化Fig.5 Changes in microstructure of chicken during storage

3 结论

在-1.5 ℃与4 ℃贮藏条件下，随贮藏时间的延长，鸡肉的L*、a*、b*值整体呈先升高后下降趋势，但-1.5 ℃贮藏鸡肉的L*值在整个贮藏期间变化趋势较为平稳；鸡肉的持水性、硬度、弹性总体下降；TBA值、TVB-N值、菌落总数均上升；T2b、T21、T22出峰值向较长时间方向移动，P21持续下降，P22持续增加，汁液流失增加；4 ℃贮藏8 d、1.5 ℃贮藏20 d时鸡肉的细胞间隙变大，结缔组织开始降解而变得模糊。-1.5 ℃贮藏鸡肉各项品质指标的变化，均明显优于4 ℃。鸡肉在4 ℃贮藏4 d和-1.5 ℃贮藏16 d时，仍符合国家二级鲜肉的标准。综上所述，冰温贮藏可明显减缓微生物繁殖、细胞酶代谢，保持鸡肉良好品质，使保鲜期延长12 d。