BHMT对高同型半胱氨酸环境下大鼠晶状体上皮细胞的保护作用△

周海燕 薛雨顺 王新川 李迪 高宁宁

晶状体蛋白质是晶状体内重要的结构蛋白，多种蛋白质的翻译后修饰可引起晶状体蛋白质结构发生变化、溶解度改变，晶状体蛋白质发生凝集、交联，影响光散射的不溶性蛋白质聚集于晶状体中央，导致光散射和晶状体透明度改变，进而引起视力下降。大量研究已证实，蛋氨酸(methionine，Met)对维持晶状体透明度非常重要，甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(betaine-homocysteine methyl transferase，BHMT)是Met循环中重要的酶。BHMT 主要在肝脏和肾皮质中大量表达,它利用同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)和提供甲基的甜菜碱(betaine，Bet)催化 Met 的再合成[1-2]。Hcy在血清中的含量随年龄增长而升高，是一种内质网应激源。而高 Hcy 是导致年龄相关性疾病的重要风险因素[3]。除此之外，还与多种眼部疾病相关[4]。在白内障的研究中，高水平的 Hcy与青少年白内障和年龄相关性白内障(age-related cataract,ARC)密切相关[5-6]。本研究通过BHMT干预Hcy孵育下的大鼠离体晶状体，检测内质网应激蛋白、细胞内ROS、抗氧化酶及凋亡相关蛋白的变化，探讨BHMT在高浓度Hcy环境下对晶状体的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料SPF级6周龄SD大鼠28只，雌雄各半。内质网应激蛋白相关的葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)试剂盒、Caspase-12试剂盒(美国Abcam公司)，抗氧化损伤类蛋白质转录因子NF-E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)试剂盒(美国Santa Cruz Biotechnology公司)，DCFH-DA、BCA蛋白定量检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(中国碧云天公司)。PBS缓冲液、Tris HCL缓冲液(pH 7.3)、β-巯基乙醇 0.2 mL考马斯亮蓝R-250、甘氨酸 2.9 g、十二烷基磺酸钠、二硫苏糖醇、碘乙酰胺、苯甲基磺酰氟、吲哚乙酸、尿素(美国Amresco公司)，Dissolution Buffer液(美国Applied Biosystem公司),Bradford蛋白浓度测定试剂盒(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法大鼠28只(56眼)，颈椎脱臼法处死后取出双眼眼球，在显微镜下完整分离晶状体后分4组 (每组7只14眼)，分别为正常组(A组)、BHMT组(B组)、Hcy+BHMT组(C组)、Hcy 组(D组)。A组:孵育在25 mol·L-1高糖-DMEM培养基；B组：孵育在 25 mol·L-1高糖-DMEM+BHMT (110 000 稀释液0.5 mL)培养液；C组：首先孵育在 25 mol·L-1高糖-DMEM+BHMT(110 000稀释液0.5 mL)培养液中12 h，然后PBS液洗脱 BHMT 3次后再加入5 mol·L-1Hcy 0.5 mL；D组：孵育在25 mol·L-1高糖-DMEM+0.5 mL的5 mol·L-1Hcy 培养液[7]。每组孵育 24 h后，检测相关指标。

1.3 检测指标

1.3.1 观察晶状体透明度的改变取出各组晶状体，于预冷的生理盐水中漂洗后置于无菌玻璃培养皿中，观察各组晶状体混浊度，并用数码相机拍照记录。

1.3.2 相关蛋白质检测利用Western blot检测以下蛋白质的表达：内质网应激蛋白GRP78，抗氧化损伤类蛋白质Nrf2、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)、凋亡相关酶Caspase-12。晶状体研磨后，进行超声粉碎。取上清 BCA 法测定蛋白浓度。加样进行SDS-PAGE 凝胶电泳、转膜及脱脂牛奶封闭，之后于 4 ℃ 冰箱内与一抗孵育过夜，室温漂洗后给予二抗孵育 1 h，再次漂洗后加入配好的显色液。凝胶成像分析系统显影。

1.3.3 细胞内ROS水平检测用撕囊镊自赤道部小心撕取大鼠晶状体前囊膜,制作大鼠晶状体上皮细胞单细胞悬液,无水乙醇溶解DCFH-DA(终浓度20 mol·L-1),每个样品收集10×103个细胞,37 ℃避光负载 30 min,使用流式细胞仪行DCFH-DA定量检测。

1.4 统计学方法利用统计学软件SPSS 19.0分析数据，计量资料用均数±标准差表示，各组结果均重复测3次，多组间比较采用单因素方差分析。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 晶状体透明度的改变体外培养24 h后可见：A、B组晶状体透明，D组晶状体混浊，C组晶状体较D组混浊程度有所减轻(图1)。

2.2 各组GRP78、Nrf2、GR、Caspase-12蛋白表达体外培养24 h后，Western blot检测结果显示：GRP78蛋白的相对表达量：A、B、C、D组分别为 0.108 1±0.021 0、0.128 2±0.013 0、0.230 5±0.021 2、1.023 5±0.303 5。D组表达量明显高于A、B、C组,与其他各组差异均有统计学意义(均为P<0.05)，而C组与A、B组比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)。见图2。

Nrf2蛋白的相对表达量：A、B、C、D组分别为0.503 3±0.022 0、0.621 2±0.023 0、0.531 2±0.011 1、0.100 5±0.013 5。D组表达量明显低于A、B、C组,与其他各组差异均有统计学意义(均为P<0.05)，而C组与A、B组比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)，见图3。

GR蛋白的相对表达量：A、B、C、D组分别为0.712 2±0.041 0、0.600 3±0.023 0、0.630 1±0.002 1、0.126 2±0.013 5。D组表达量明显低于A、B、C组,与其他各组差异均有统计学意义(均为P<0.05)，而C组与A、B组比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)。见图4。

Caspase-12蛋白的相对表达量：A、B、C、D组分别为0.050 1±0.011、0.121 2±0.033、0.237 5±0.021 2、1.017 5±0.063 5。D组表达量明显高于A、B、C组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)，而C组与A、B组比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)。见图5。

2.3 细胞内ROS水平检测体外培养24 h后，使用流式细胞仪行细胞内DCFH-DA定量检测显示,A、B、C、D组荧光强度分别为(55.025 0±0.131 0)%、(58.012 3±0.231 0)%、(63.362 5±0.250 2)%、(98.150 2±0.260 6)%。D组明显高于A、B、C组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)，而C组与A、B组比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)。见图6。

图1 大鼠晶状体混浊度的改变。A：A组；B：B组；C：C组；D：D组

图2 大鼠晶状体GRP78蛋白的Western blot分析结果。A：A组；B：B组；C：C组；D：D组

图3 大鼠晶状体Nrf2蛋白的Western blot分析结果。A：A组；B：B组；C：C组；D：D组

图4 大鼠晶状体GR蛋白的Western blot分析结果。A：A组；B：B组；C：C组；D：D组

图5 大鼠晶状体Caspase-12蛋白的Western blot分析结果。A：A组；B：B组；C：C组；D：D组

图6 大鼠晶状体细胞内 ROS 水平检测。A：A组；B：B组；C：C组；D：D组

3 讨论

前期我们利用基于同位素相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)标记的蛋白质组学技术，分析了不同年龄人群白内障晶状体核与透明晶状体核间的差异蛋白质,并首次报道了BHMT在高龄组白内障晶状体核区的水平较年轻组明显下调，进一步通过新的临床白内障晶状体标本进行了验证[8]。但其在晶状体老化和白内障形成中如何参与代谢等确切机制尚未完全清楚。在胎儿晶状体文库中，BHMT 是一个大量表达的基因[9]。Rao等[10]第一次在恒河猴的晶状体核中发现了BHMT，其表达占核部总蛋白的0.5%～10.0%，作者推测其和Met的代谢相关，但具体机制尚不清楚。BHMT主要在肝脏和肾皮质中有较大量表达,它利用Hcy和Bet催化Met的再合成[1-2]。Hcy是Met循环过程中的中间代谢产物。高Hcy除了与心血管疾病、神经性疾病、糖尿病等全身疾病相关外，与白内障等眼部疾病的发生发展密切相关[4]。有研究认为，高浓度Hcy可以诱导晶状体细胞发生严重的氧化应激反应，引起白内障的发生和发展[7,11]。Hcy升高导致大量ROS产生，诱导细胞死亡和凋亡,可能导致了皮质性白内障的形成[12]。而后囊下白内障的形成可能与玻璃体内Hcy的含量增多有关[13]。遗传性高胱氨尿酸患者心血管疾病、白内障、青光眼疾病高发，被认为Hcy是造成机体老化的重要因素，血清中大约80%Hcy通过二硫键与纤维连接蛋白或白蛋白结合[14]，但其余20%游离于血清中存在很长时间[15]。游离的Hcy被半胱氨酸膜转运蛋白内化入晶状体细胞[16]，高浓度Hcy可造成晶状体细胞的严重损伤，其作用机制被认为与内质网应激相关。Hcy诱导了内质网应激压力,启动了UPR，并导致晶状体上皮细胞中ROS的产生而降低了游离谷胱甘肽的数量,削弱了氧化防御系统，加剧了氧化的环境,导致晶状体发生氧化损伤。研究发现，在相同的诱导条件下BHMT转基因小鼠的高Hcy血症发病率明显低于对照组，并可保护肝脏细胞免受高同半胱氨酸浓度的损伤[17]。Zhang等[18]发现两种 miRNAs 通过分化靶向海刺参中BHMT来直接影响体腔细胞中Hcy含量，靶基因BHMT siRNA或补充Hcy均可明显促进体腔细胞ROS的产生，表明靶基因BHMT通过调控Hcy的含量发挥生物学功能。我们用5 mol·L-1Hcy培养晶状体24 h。Western blot分析显示，24 h的暴露足以诱导HLECs中UPR特异性蛋白的表达。从实验结果看,加入BHMT干预后,发现细胞内ROS水平较Hcy单纯处理组明显降低,Nrf2作为重要的氧化还原敏感性转录因子被激活后表达明显增加，发挥了抗氧化性能，明显减轻了晶状体上皮细胞氧化损伤，抑制了Caspase-12的表达，最终表现为晶状体混浊度减轻。BHMT在体外可以有效防护高Hcy环境下晶状体氧化损伤,清除ROS,阻止细胞凋亡,证明了其在防治与Hcy有关的疾病方面的积极作用，将为白内障氧化损伤机制提供新的依据。