中国北方一先天性白内障家系GJA8基因新突变

王凡 陈迪 焦婷 杨会琴

先天性白内障是儿童时期常见的致盲性眼科疾病，其中8%～25%患者与遗传有关[1]，多数表现为单基因遗传病，其遗传方式包括常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、性连锁相关遗传，其中常染色体显性遗传是其最常见的遗传方式[2]。单基因遗传性白内障既可单独发病，也可伴随其他眼部发育异常，如小角膜、无虹膜、视网膜病变等[3]。先天性白内障晶状体混浊类型分为核性、绕核性、前极性、后极性、粉尘状、缝状、珊瑚状、全白内障等[4]。目前已报道与先天性白内障有关的致病基因有40多种，主要是调控晶状体蛋白合成的晶状体蛋白基因和膜蛋白基因(GJA1、GJA3、GJA8、MIP、MP19)，部分为调节眼球发育的基因，还有少量其他基因，如热休克蛋白转录因子4等[5]。在先天性白内障的致病基因中，晶状体蛋白基因突变约占1/2，缝隙连接蛋白基因突变约占1/4[3]。本研究拟分析一个常染色体显性遗传的先天性白内障家系，确定其致病基因，分析其基因型与表型相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象收集中国一个先天性白内障家系，该家系共有四代14人，其中白内障患者5例，正常亲属9人。本研究遵循赫尔辛基宣言并经郑州大学第一附属医院伦理委员会批准，全部参与者均签署了知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 家系病历采集详细询问家族史、绘制家系图谱(图1)，并进行全面的眼科检查，包括普通视力及最佳矫正视力、裂隙灯显微镜、直接检影镜眼底检查。

1.2.2 DNA提取抽取该家系所有成员外周静脉血2 mL，EDTA抗凝，-4 ℃保存。采用康为世纪CW0544试剂盒进行DNA分离、提取，-80 ℃保存备用。

图1 一先天性白内障家系图谱。圆形代表女性，方形代表男性，空心表示正常，实心表示患者，箭头表示先证者，斜线表示已去世

1.2.3 致病基因检测采用二代测序方法进行基因分析，程序如下：用酶切法将DNA样本进行片段化，末端修复，3’末端加“A”，再加接头得到350～400 bp的片段，进行PCR富集，最后利用生物分析仪(安捷伦科技有限公司安捷伦2100)进行文库构建分析，设计60 bp标记生物素的探针结合目标区域基因的外显子，采用液相捕获试剂盒(北京迈基诺基因科技股份有限公司)将目标基因捕获后用新一代测序仪(Illumina公司illuminaNextSeq 500)进行二代测序，并进行生物信息分析。对发现的变异进行Sanger测序验证。

1.2.4 致病性分析家系共分离分析：对收集的其他家系成员进行突变位点的Sanger测序，确定其基因型。保守性比对：比较此位点所编码的氨基酸在不同位点间氨基酸序列的保守性。功能预测软件分析：运用在线分析软件PolyPhen-2和SIFT帮助判断其致病性。检索正常人群数据库(北京迈基诺基因科技股份有限公司)，判断该变异是否存在于正常人群。

2 结果

2.1 家系资料及遗传学特征该家系共四代14人，其中5例患有先天性白内障，表现为常染色体显性遗传，患者男女比例为23，均无其他眼部疾病及全身性疾病。先证者IV2为一名3岁男孩，自幼视物不清伴眼球震颤，双眼视力均为0.025，双眼水平震颤、频率快，无明显休止眼位，同时注视时角膜映光点为+30°～+35°，固视不良，双眼晶状体呈全白色混浊。术前眼底模糊，眼B超检查未见眼后段异常，术后双眼散瞳查眼底无明显异常。其母亲III3晶状体混浊类型为双眼点状晶状体混浊(图2),右眼视力0.04,左眼视力0.03，眼位正；眼B超检查未见眼后段异常，术后眼底检查未见异常。其他3例患者均为双眼患者且已行白内障摘出术，白内障形态未知，眼底未见异常改变。

图2 家系中患者眼前段照相。A:先证者：晶状体全白色混浊；B：先证者母亲：点状晶状体混浊

2.2 突变结果分析基因检测发现，该家系先证者及其他白内障患者的GJA8基因的第二外显子存在杂合错义突变(c.199G>T)(图3)，该突变导致GJA8基因编码的Cx50蛋白第67位氨基酸D被Y代替(p.Asp67Tyr)，该突变在正常亲属中均未发现。在不同物种该突变所在位点的氨基酸具有高度保守性。信息分析工具PolyPhen-2和SIFT均提示其为白内障致病性变异。

图3 该家系GJA8基因测序图。上图为正常对照；下图为GJA8 c.199G>T 的错义突变

3 讨论

晶状体的透明性主要靠晶状体内相对稳定的离子、水分、pH值以及晶状体蛋白的有序排列。晶状体自身无血管，其营养物质获得、新陈代谢以及物质循环依赖晶状体缝隙连接蛋白[3]。缝隙连接蛋白在晶状体细胞间通讯中起着重要作用，对晶状体细胞的存活、功能和维持晶状体的均质性和透明性尤其重要[6]。晶状体中的缝隙连接蛋白有三种：Cx43、Cx46以及Cx50，分别由GJA1、GJA3和GJA8编码[7]。GJA8基因位于1q21.1,含1612 bp、2个外显子区域，编码由433个氨基酸组成的连接蛋白Cx50，在晶状体纤维细胞和上皮细胞中高表达，并参与晶状体组织的生长和分化[8]。Cx50是一种膜蛋白，包括四个跨膜区(M1、M2、M3和M4)、两个胞外结构域(E1、E2)和三个胞内结构域(1个细胞质内环及细胞质C端和N端)[9]。相邻六个细胞外环作用形成连接子，相邻两个连接子互相连接，形成细胞间缝隙连接通道。细胞间缝隙连接通道参与细胞间信号转导和物质运输，对细胞的生长、分化、凋亡和肿瘤的形成等有重要的调节作用[10]。此外，这些蛋白参与细胞周期调节，特别是GJA8(CX50)，还参与细胞周期阻滞[11]。这些蛋白的突变造成原发性或继发性晶状体纤维形成，导致白内障发生。通过不同物种间的多序列比对、分析，缝隙连接蛋白胞外环是缝隙连接通道中重要且高度保守的结构域，Cx50E1环在连接蛋白对接中作用重大，环内氨基酸的突变导致细胞间偶联丢失，形成功能缺失突变[12-16]。有文献报道，Cx50基因突变时小鼠无法形成正常间隙通道导致白内障及小眼球发生[17-18]。

目前已确定与先天性白内障有关的GJA8突变有40种，其中错义突变38种，移码突变2种；绝大部分表现为常染色体显性遗传(36种)，仅2种表现为隐性遗传。导致的先天性白内障类型中核性最多见，也可表现为粉尘状、全白、缝状等，伴或不伴随先天性小角膜，未见明确的基因型与表型相关性[16,19-23]。

本研究中，该家系所有白内障患者均在GJA8基因的第二外显子中发现了杂合的错义突变(c.199G>T)，而在正常亲属及正常人群数据库中均未发现相同改变。保守性比对、致病性预测软件分析均提示其有致病性，可以明确此突变是导致该家系发生先天性白内障的原因，导致细胞外区域发生改变影响到细胞间的耦合和缝隙连接形成，进一步影响晶状体正常代谢，这可能是该家系先天性白内障的发病机制。