促进玉米直链淀粉回生的甘薯淀粉晶种的筛选及表征

郭俊杰,杨 璐,白正晨,孟宪昉,王 倩,连喜军

(天津商业大学,天津市食品生物技术重点实验室,生物技术与食品科学学院,天津 300134)

淀粉的回生也称淀粉的β-化或老化[1-2]。淀粉回生过程的本质就是糊化淀粉分子从高能无序态到有序态转化的过程。即糊化后的淀粉分子借助氢键相互吸引,形成排列有序、高度致密、结晶化的不溶性分子微束[3]。淀粉回生的主导驱动力是范德华力和氢键,大量分子内和分子间氢键的形成速度决定了淀粉的回生速度[4-8]。淀粉回生结晶过程经历三个阶段:晶核生成、晶核增长和形成规则结晶。

常规回生淀粉的制备方法时间长,收率低(低于45.7%)[9]。而在淀粉回生过程中,晶核将要开始产生之前,加入一定量的晶种,使溶液局部形成合适的过饱和度,溶液受到晶种的刺激后,晶核可以提早形成,且不会引起刺激产生更多的晶核,因此可以培养出粒度均匀、形貌规则的结晶,并可显著提高淀粉的回生率。添加的晶种相当于淀粉类食品在存储过程中自身形成的结晶,而目前晶种促进淀粉回生的研究还很少,连喜军等[10]进行的添加回生淀粉晶种促进玉米淀粉回生的研究表明,晶种中出现了21个面的明显晶体特征,而该晶种在玉米淀粉糊中长大后晶面减少到12个左右,并显著提高了玉米淀粉的回生率。孟宪昉等[11]的研究表明,草酸侵蚀马铃薯回生淀粉晶种对玉米淀粉回生具有明显的促进作用。晶种添加影响淀粉从凝胶向晶种聚集的动力,加速淀粉回生。

甘薯淀粉具有很高的分支度,特定的空间结构使淀粉分子链不易聚合,更易形成特定的面,从而使淀粉分子在面上有序排列形成规则结晶。而玉米淀粉分支度低,其本身结构受多次重复回生的影响[12],分子量分布范围明显变窄[13]。在溶液中,淀粉分子移动快,易于有序聚集在晶核上,从而形成有序排列的规则晶体,同时提高淀粉的回生率。

本文以草酸侵蚀四次回生的甘薯淀粉、甘薯直链淀粉、甘薯支链淀粉,并以其为晶种添加到四次回生的玉米直链淀粉中,研究晶种对玉米直链淀粉回生的影响,筛选出对玉米直链淀粉回生促进最佳的晶种。通过可见吸收、X-射线衍射、红外光谱、差热扫描等的研究,得到甘薯回生淀粉晶种促进玉米直链淀粉长晶的原因。以期为提高淀粉的回生率、研究回生淀粉结晶结构提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小麦粉、玉米淀粉 为市售;高温α-淀粉酶(酶活力 25000 U/mL) 天津市诺奥科技发展有限公司;氯化钠、盐酸、氢氧化钠、碘、碘化钾 均为国产分析纯。

YX-280D(电脑型)手提式压力蒸汽灭菌器 合肥华泰医疗设备有限公司;XMTD-204数显式电热恒温水浴锅 天津欧诺仪器仪表有限公司;DH-101-3BS电热恒温鼓风干燥箱 天津市中环实验电炉有限公司;BCD-229KB海尔冰箱 青岛海尔股份有限公司;L535-1湘仪低速离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司;SL2002电子精密天平 上海民桥精密科学仪器有限公司;YD202N电子天平 上海精密科学仪器有限公司;岛津UV-2450/2550紫外可见分光光度计 日本Shimadzu公司;D/max-2500X-射线衍射分析仪 日本理学公司;Bio-Rad FES135红外分光光度计 美国Bio-Rad公司;Q20差热扫描量热器 美国TA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 直、支链淀粉的制备

1.2.1.1 支链淀粉的制备 在20 L不锈钢桶中配制13 L 0.15 mol/L的NaOH溶液;将300 g干甘薯淀粉分散于1 L水中,使之完全溶解;将分散的淀粉乳液缓慢倒入NaOH溶液中,边倒边搅拌,约搅拌5 min,静置10 min;将配制的3.6 L 5%的NaCl溶液倒入静置的溶液中,搅拌均匀,用盐酸调节pH在6.5～7.5之间,静置20 h后离心(4000 r/min,5 min),弃去上层液,下层为支链淀粉粗提取液。

在支链粗提取液中加入10 L 1% NaCl溶液,搅拌均匀静置20 h,离心(4000 r/min,5 min)后弃去上层液(盐析),盐析3～4次,加入适量无水乙醇浸泡24 h,离心(4000 r/min,5 min),再用乙醇洗几次(用碘液测试变为紫红色即可),沉淀即为湿甘薯支链淀粉。

1.2.1.2 直链淀粉的制备 称取甘薯淀粉100 g,置于1 L的烧杯中,加入750 mL水搅拌均匀,于95 ℃的水浴锅中加热并不停搅拌,当淀粉近似透明时,放入压力蒸汽灭菌器中,121 ℃高压糊化40 min。然后将冷至室温的样品于冰箱内4 ℃老化3 d。将老化后的淀粉用6 mL高温淀粉酶酶解、过夜,充分洗涤弃去上清液得到一次回生的淀粉。将得到的淀粉用4 mol/L的KOH溶液溶解,浓盐酸调节pH至中性。向溶液中加入正丁醇(体积为KOH的2～3倍),搅拌、离心(4000 r/min,5 min)后得湿甘薯直链淀粉。

用同样方法制备玉米直链淀粉。

1.2.1.3 四次回生的淀粉制备 将玉米直链淀粉、甘薯直链淀粉、甘薯支链淀粉及甘薯原淀粉继续重复1.2.1.2部分中步骤(糊化、高压糊化、老化、酶解、水洗),直至得到四次回生的淀粉。

1.2.2 晶种的处理 将四次回生后的湿甘薯淀粉、甘薯直链及甘薯支链淀粉各20 g分别置于200 mL烧杯中,用0.1 mol/L的草酸溶液100 mL浸泡30 min,置于121 ℃压力蒸汽灭菌器中高压处理20 min,取出后水洗离心(4000 r/min,5 min)得到3种晶种,备用。

1.2.3 加晶种长晶 取相当于10 g干淀粉的湿玉米直链淀粉于100 mL烧杯中,按照干燥淀粉比例的1.0%(0.1 g)分别加入甘薯淀粉、甘薯直链及甘薯支链淀粉晶种,在湿的状态下混合均匀,再加入等质量的蒸馏水,搅拌均匀后置于95 ℃水浴锅中糊化1 h,然后置于121 ℃高压锅中高压处理40 min,平行做三份。第一份置于40 ℃恒温培养箱中长晶24 h,干燥后待测;另一份直接置于干燥箱中65 ℃烘干,称重;第三份加入高温淀粉酶置于95 ℃水浴锅中酶解1 h,水洗离心后干燥,称重,按下式计算出回生率[14-15]。

回生率(%)=(酶解后的淀粉总干重-酶解后晶种干重)/(未酶解的淀粉总干重-晶种干重)

1.2.4 可见吸收光谱分析 将40 mL蒸馏水和约0.1 g湿样品加入到100 mL的烧杯中,加热1 h。再加入1滴碘液(KI+I2),慢慢搅拌的均匀后,静置约30 min,取上层清液进行可见光吸收测定,波长范围为500～700 nm。

1.2.5 X-射线分析 用铜箔和镍箔包裹淀粉粉末,采用X-射线衍射仪扫描,扫描电流和电压分别为27 mA和50 kV。扫描衍射角(2θ)为4～40,步长为0.05,间隔时间为2 s。

1.2.6 红外光谱分析 将淀粉粉末用光谱纯KBr压片,在27 ℃下用红外分光光度计Bio-Rad FES135测定淀粉红外吸收,扫描范围4 000～400 cm-1。

1.2.7 DSC分析 采用Q20差热扫描量热器,在氮气保护下,对淀粉粉末进行热性能测试,扫描温度范围30～240 ℃,升温速率5 ℃/min。

1.3 数据处理

运用软件OriginPro 8.5 绘制图表,分析不同晶种对玉米直链淀粉回生的影响;Jade 6.0分析样品的X-射线数据;TA Universal Analysis 2000计算样品的热性能数据。

2 结果与讨论

2.1 晶种促进四次回生的玉米直链淀粉的回生率

由表1可知,玉米直链淀粉经过四次回生,其回生率为40.2%,而添加晶种可使玉米直链淀粉的回生率超过50%。表明这三种晶种均明显促进了玉米直链淀粉的回生。以甘薯直链淀粉为晶种,玉米直链淀粉回生率可达59.5%,比不添加晶种提高了19.3%。表明该晶种对玉米直链淀粉回生的促进作用最大。

表1 晶种促进四次回生的玉米直链淀粉回生的回生率Table 1 The four times retrogradation rate of maize amylose promoted by sweet potato seeds

2.2 可见吸收光谱

图1和图2分别为草酸处理过的甘薯原淀粉、甘薯直链、甘薯支链淀粉及以之为晶种促进玉米直链淀粉回生长晶的可见吸收光谱图。

图1 草酸处侵蚀的甘薯淀粉晶种的可见吸收光谱图Fig.1 Visible absorption spectra of sweet potato starch seeds treated by oxalic acid

根据文献,只有聚合度(DP)为30～60的淀粉才可以形成回生淀粉[16-17]。由图1可知,用草酸处理过的甘薯淀粉样品均出现可见吸收,由此可得该方法处理的甘薯淀粉保持了双螺旋结构。从微观的角度分析,用草酸处理过后,淀粉的结构改变了,即甘薯淀粉分子链断裂了。

碘分子嵌入淀粉的双螺旋结构内部,形成络合物的最大吸收波长取决于淀粉分子的重复单元数目[18]。由图2可知,以草酸处理过的甘薯淀粉、甘薯直链淀粉及甘薯支链淀粉为晶种促进玉米直链淀粉长晶的样品均出现了明显的可见吸收,即该方法处理的玉米直链淀粉都保持了双螺旋结构。且无晶种的玉米直链淀粉具有最大的可见吸收波长(570 nm),表明玉米直链淀粉具有较多的重复单元数目。

图2 草酸侵蚀的甘薯淀粉晶种促进玉米 直链淀粉长晶的可见吸收光谱曲线Fig.2 Visible absorption spectra of retarded maize amylose promoted by oxalic acid treating sweet potato starch seeds

2.3 X-射线衍射分析

图3和图4分别为草酸处理过的甘薯淀粉、甘薯直链淀粉、甘薯支链淀粉及以之为晶种的回生玉米直链淀粉XRD曲线。

图3 草酸侵蚀的甘薯淀粉的XRD曲线Fig.3 XRD spectra of sweet potato starch treated by oxalic acid

图4 草酸侵蚀的甘薯淀粉晶种促进 玉米直链淀粉长晶的XRD曲线Fig.4 XRD spectra of retarded maize amylose promoted by oxalic acid treating sweet potato starch seeds

由图3可知,经草酸处理过的四次回生甘薯淀粉、直链淀粉及支链淀粉的衍射峰分别在14、16、21、24°附近出现,说明其结晶结构为A+B型[19],且甘薯支链淀粉的衍射峰比较明显,表明晶面增加,晶体结构特征增加。

由图4可知,回生直链淀粉的晶型为B型[20],衍射角(2θ)为5.2、16.9、22.2、26.6°。以草酸处理甘薯淀粉为晶种回生的玉米直链淀粉及四次回生的玉米直链淀粉衍射峰在6、17、23、26°附近出现,

图5 草酸侵蚀的甘薯淀粉晶种及其促进玉米直链淀粉长晶的红外谱图Fig.5 IR spectra of sweet potato starch treated by oxalic acid and retarded maize amylose promoted by sweet potato starch seeds注:a. 甘薯淀粉;b. 甘薯直链淀粉;c. 甘薯支链淀粉;d. 甘薯淀粉为晶种;e. 甘薯直链淀粉为晶种;f. 甘薯支链淀粉为晶种。

为B型结晶结构。表明玉米直链淀粉在甘薯淀粉晶种上明显生长,且保持了甘薯淀粉晶种的形貌结构,即甘薯淀粉晶种显著地促进了玉米直链淀粉长晶。

2.4 红外光谱分析

草酸侵蚀的甘薯淀粉晶种及其对玉米直链淀粉回生长晶的红外表征表明,所有样品均在3400、2920 cm-1处出现了羟基伸缩振动峰及C-H键的伸缩振动峰。羟基与水的变形振动出现在1640 cm-1附近,草酸侵蚀的甘薯淀粉、甘薯直链淀粉、甘薯支链淀粉及以之为晶种的玉米淀粉长晶后该峰从1649、1639、1629 cm-1迁移至1650、1646、1641 cm-1,以甘薯淀粉和甘薯直链淀粉为晶种的玉米直链淀粉长晶,羟基与水的变形振动峰变化值较小,表明二者结构较为相似。代表C-O键的伸缩振动出现在1155～1160 cm-1,代表O-H键弯曲振动的强峰则出现在999～1020 cm-1。

2.5 DSC分析

由图6a、b、c和表2可知,三种样品中,甘薯淀粉具有最高的峰值温度146 ℃,而甘薯支链淀粉具有最高的吸热焓,说明甘薯支链淀粉的晶体含量最高,结构更难破坏。以三种淀粉为晶种,玉米直链淀粉长晶的谱图表明,以甘薯直链淀粉为晶种的样品的峰值温度最高为146 ℃。而三种样品的焓值差别不大,但均远高于晶种的焓值,表明三种样品的结构较为相似,晶体含量也较为接近,但其结构更加稳定。

表2 草酸侵蚀的甘薯淀粉晶种及其添加后回生玉米直链淀粉的热力学性能Table 2 Thermodynamics properties of sweet potato starch treated by oxalic acid and retarded maize amylose promoted by sweet potato starch seeds

图6 草酸侵蚀的甘薯淀粉晶种及其促进玉米直链淀粉长晶的DSC曲线Fig.6 DSC spectra of sweet potato starch treated by oxalic acid and retarded maize amylose promoted by sweet potato starch seeds注:a. 甘薯淀粉;b. 甘薯直链淀粉;c. 甘薯支链淀粉;d. 甘薯淀粉为晶种;e. 甘薯直链淀粉为晶种;f. 甘薯支链淀粉为晶种。

3 结论

甘薯淀粉晶种显著地促进了玉米直链淀粉回生,其中甘薯直链淀粉晶种对玉米直链淀粉的回生的促进最大(回生率59.5%);玉米直链淀粉长晶后出现了B型衍射峰,具有明显的晶体特征;玉米直链淀粉在甘薯淀粉上进一步生长,既保持了晶种的晶型，又提高了玉米直链淀粉的回生率,并得到了较为规则形貌的玉米淀粉样品。该研究为提高淀粉的回生率、研究回生淀粉结晶结构提供良好的技术支持。