杜仲治疗骨质疏松的网络药理学作用机制探讨

董航， 严娇， 谢铱子， 纪树亮， 孙伟鹏， 孙治中， 李宗瑶

（1.广州中医药大学第一附属医院三骨科，广东广州 510405；2.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510405）

骨质疏松（osteoporosis，OP）好发于中老年人，是由多种因素导致的一种全身骨代谢性疾病。骨质疏松患者骨脆性增加，主要临床症状为疼痛、身长缩短、驼背等。其最严重的并发症是骨折，给患者带来了沉重的经济负担和身心的双重痛苦[1]。有关资料显示，骨质疏松的发病率已高居世界各种常见疾病中的第7位。随着我国逐渐步入人口老龄化社会，骨质疏松的治疗日渐受到重视[2]。然而，许多临床研究结果表明，临床上常用的抗骨质增生西药均具有一定的不良反应，如长期使用激素治疗的患者，其罹患乳腺癌、子宫内膜癌、冠心病等疾病的几率将有不同程度的升高[3，4]。骨质疏松的临床症状与中医疾病“骨痿”、“骨痹”、“骨枯”中的“不通则痛”、“腰脊不举”、“两足软弱”、“不任其身”等表现相符。中医以“骨痿”、“骨痹”或“骨枯”论治骨质疏松，重温补肾阳、强筋壮骨，兼以通经活络、祛风除湿、补气养血[5]。其注重整体调理，且毒副作用小、简便廉验的优势，得到越来越多医生和患者的认可，逐渐受到了关注[6，7]。

杜仲为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥树皮。其味甘，性温，归肝、肾经，具有补肝肾、强筋骨、安胎的功效，主治肾虚腰痛、足膝痿弱。《神农本草经》言其“主腰脊痛，补中，益精气，坚筋骨”。有研究发现，杜仲能够显著提高大鼠血清钙和雌二醇水平，同时降低骨钙素及碱性磷酸酶的含量，从而治疗大鼠去卵巢后引起的骨质疏松，且盐制杜仲的疗效优于生杜仲[8]。另外，杜仲的有效成分还具有减慢大鼠去势引起的骨质量下降及骨小梁减少，促进骨钙素、骨保护素mRNA和护骨素蛋白表达的作用[9-11]。临床研究表明，杜仲及其中成药能显著降低骨质疏松患者血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）、I型前胶原N端前肽（PINP）、转化生长因子β（TGF-β）水平，上调血清血管内皮生长因子（VEGF）水平，改善骨质疏松患者的骨代谢与骨密度情况[12，13]。当前对杜仲治疗骨质疏松作用机制的研究主要为动物实验和临床实验，但仍不能整体、全面地反映杜仲作用机制网络。

网络药理学是基于系统生物学的理论，对生物系统的网络分析，选取特定信息节点进行多靶点药物分子设计的新学科。其融合系统生物学、多向药理学、生物信息学、计算机科学等多学科的技术和内容，进行“疾病表型——基因——靶点——药物”等多层次网络的构建，探索药物与疾病间的关联性，指导新药研发，阐明药物作用机理。

杜仲治疗骨质疏松是多组分、多环节、多靶点综合作用的结果，针对单一靶点进行研究，难免存在局限性。网络药理学整体性、系统性及复杂性的研究角度和研究方法，正与中医药特点相符合。遵循传统中医药理论，应用多种现代医学先进的理论和技术手段，深入探讨杜仲防治骨质疏松的机理，从整体上阐明其改善机体的调节作用机制，是中药现代化发展的需要。因此，本研究采用网络药理学方法从整体角度对杜仲治疗骨质增生的作用机制进行探讨，以期为深入研究杜仲及含有杜仲的中药复方的抗骨质疏松作用和临床应用提供参考依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1药物活性成分的获取通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/，Version 2.3），以“杜仲”作为关键词进行检索，设置限定条件为口服利用度（OB）＞30%，类药性（DL）＞0.18，获取杜仲同时符合上述两个条件的所有化学成分信息。利用Pubchem检索出所有活性成分各自的3D结构，保存为mol2格式。

1.2活性成分作用靶标及骨质疏松作用靶标相应基因的获取反向分子对接服务器（DRAR-CPI）是可以基于反向分子对接方法，对药物活性成分与蛋白的作用强度进行打分的服务器[14]。将上述检索所得的杜仲治疗骨质疏松的活性成分的mol2格式导入DRAR-CPI，按服务器所推荐，选取Z-score＜-0.5的蛋白作为杜仲活性成分的预测靶标。于UniProt数据库中检索“杜仲”蛋白靶标的蛋白数据库（PDB）ID，限定物种为“Human”，从而得到相应的基因靶标。以“osteoporosis”或“OP”作为关键词在GeneCards数据库和在线人类孟德尔遗传（OMIM）数据库中进行检索，收集与骨质疏松相关的靶标基因，并与上述检索所得的杜仲的活性成分作用的靶标基因进行比对，以筛选出共同靶标。

1.3成分——靶标作用网络构建与分析将杜仲的活性成分与抗骨质疏松作用靶标导入Cytoscape 3.6.0软件，构建其“成分——靶标”网络。

1.4核心靶标相互作用网络构建与分析在String数据库中检索杜仲治疗骨质疏松的潜在靶标获取相互作用关系，将其导入Cytoscape 3.6.0软件，绘制蛋白相互作用关系网络，使用Cytoscape的Network Analyzer功能对其进行网络分析，调节节点大小的颜色以反映Degree的大小，最终获得蛋白相互作用网络图。

1.5分子对接Systems Dock Web Site分子对接服务器是基于DocK-IN评分的分子对接功能对蛋白质——配体结合潜力进行评估[15]。筛选上述Degree值排名前5位的靶标，将其导入Systems Dock Web Site分子对接服务器中与杜仲的活性成分进行分子对接，并分析分子对接结果的Docking Score，用于对杜仲活性成分与核心靶标之间结合活性的评价。

1.6生物学过程与通路分析利用DAVID数据库对杜仲的作用靶标进行基因本体论（GO）分析与京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，得到通路富集结果，选取其中P＜0.001的通路，将富集基因数按降序排列，选取前20名的通路，利用OmicShare网站绘制通路信息图。

1.7成分——靶标——通路网络构建通过分析排名前20的KEGG通路，结合文献检索，筛选出其中可能与治疗骨质疏松相关的通路，找出富集在上述通路上的杜仲抗骨质疏松的潜在靶标，并与相应的活性成分相对应，最终构建“成分——靶标——通路”多维网络关系图。

2 结果

2.1杜仲活性成分分析在TCMSP数据库中收集杜仲的化学成分，以OB＞30%，DL＞0.18为筛选标准，得到具有抗骨质疏松作用的活性成分28个，具体见表1。

2.2靶标预测在DRAR-CPI服务器中搜索杜仲28个活性成分对应的潜在靶标，共获得386个，剔去重复靶标后获得265个潜在靶标。在Uniprot数据库中输入潜在靶标的PDB ID，得到基因靶标123个。通过OMIM、GeneCards数据库中骨质疏松相关基因的比对，筛选出可能有抗骨质疏松作用的潜在靶标61个，具体见表2。

2.3成分——靶标网络构建在Cytoscape软件中输入活性成分与潜在靶标的相关数据，构建杜仲的成分——靶标网络，见图1。图中涉及节点80个，边387条。不同的节点代表的意义不同，橙色六边形节点表示活性成分，蓝色圆形节点表示潜在靶标，边表示活性成分与潜在靶标之间互相关联。由成分——靶标网络可知，杜仲治疗骨质疏松具有多成分、多靶标的特点，非单一成分、单一靶标作用而成。

2.4靶标相互作用网络构建使用String数据库获取杜仲与骨质疏松相关靶标的相互作用关系，导入Cytoscape软件，构建靶标相互作用网络，见图2。网络中的节点代表蛋白靶标，边代表蛋白靶标之间的相关性。蛋白靶标的Degree值大小通过节点颜色和大小来体现，节点越大、颜色越深说明Degree值越大。由图2可知靶标相互作用网络共涉及节点61个，边453条。通过Degree值与现有研究结果推测杜仲抗骨质疏松作用与甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）、骨钙素（bone Gla protein，BGP）、过氧化物酶增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Runt相关转录因子2（runt-related protein 2，RUNX2）有关。

2.5分子对接选取靶标相互作用网络中Degree值靠前的5个靶标PTH、BGP、PPAR、ALP、RUNX2，通过Systems Dock Web Site软件与杜仲的28个活性成分进行分子对接，结果Docking Score值＞7.0的有10个（7%），在7.0～5.0之间的有76个（54%），在4.25～5.0之间的有38个（27%），＜4.25的有16个（11%）。Docking Score值＞4.25表示分子和靶标具有一定的结合能力，＞5.0表示结合能力较高，＞7.0表示结合能力很高，见图3。因此，分子对接验证结果提示，杜仲的活性成分和靶标之间具有良好的结合能力。

表1 杜仲活性成分表Table 1 Active components of Cortex Eucommiae

2.6 GO和KEGG通路富集分析对杜仲活性成分的相应靶标进行GO和KEGG通路富集分析，以P＜0.05为阈值，筛选出靠前的通路与生物过程（见图4～7）。GO富集分析包括细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物过程（biological process，BP）3部分。结果BP分析排名较前的为Wnt信号通路（Wnt signaling pathway），钙调节通路（calcium modulating pathway）、蛋白激酶活性激活（activation of protein kinase activity）、流出道形态发生（outflow tract morphogenesis）、化学突触传导（chemical synaptic transmission）、凋亡程序正调控（positive regulation of apoptotic process），见图4。MF分析排名较前的为Wnt激活受体活性（Wnt-activated receptor activity）、细胞因子活性（cytokine activity）、速激肽受体活性（tachykinin receptor activity）、蛋白异源二聚体活性（protein heterodimerization activity）、酶绑定（enzyme binding），见图5。CC分析排名较前的为受体复合物（receptor complex）、神经细胞体（neuronal cell body）、 侧 浆 膜（lateral plasma membrane）、细胞皮层（cell cortex）、高尔基腔（Golgi lumen），见图6。KEGG通路富集分析结果显示杜仲治疗骨质疏松的靶标主要与磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/丝苏氨酸蛋白激酶Akt、血管内皮生长因子（VEGF）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、叉头框蛋白O（FoxO）信号通路及人嗜T淋巴细胞病毒I型（HTLV-I）感染等相关，见图7。

表2 杜仲潜在靶标信息列表Table 2 The information of the candidate targets of Cortex Eucommiae

图1 杜仲成分——靶标网络Figure 1 The component-target network of Cortex Eucommiae

图2 杜仲靶标相互作用网络Figure 2 The candidate target interaction network of Cortex Eucommiae

图3 分子对接图Figure 3 The diagram for molecular docking

图4 杜仲活性成分对应靶标的BP分析Figure 4 The analysis for biological processes of candidate targets of active components in Cortex Eucommiae

图5 杜仲活性成分对应靶标的CC分析Figure 5 The analysis for cellular component of candidate targets of active components in Cortex Eucommiae

图7 杜仲活性成分对应靶标的KEGG通路富集分析Figure 7 KEGG pathway enrichment analysis for candidate targets of active components in Cortex Eucommiae

2.7杜仲成分——靶标——通路网络构建依据现有研究成果筛选出可能具有抗骨质疏松作用的通路，将其与杜仲的活性成分与潜在靶标一一对应，构建成分——靶标——通路多维网络，见图8。由图8分析可得，杜仲治疗骨质疏松涉及的活性成分共12个。这些活性成分作用的靶标包括PTH、BGP、PPAR、ALP、RUNX2等共35个，主要涉及PI3K-Akt、VEGF、AMPK、Notch、核因子kappa B（NF-κB）、FoxO、HTLV-I等7个信号通路。

3 讨论

杜仲属杜仲科植物，有补益肝肾、强筋壮骨、安胎元之效[16]。《神农本草经》记载其“主治腰膝痛，补中，益精气，坚筋骨”。近年来许多动物实验与体外实验结果表明，杜仲通过提高雌激素水平、调节骨代谢相关细胞因子以及促进护骨素形成等发挥抗骨质疏松作用，但其机理尚未明确[17]。因此，研究杜仲治疗骨质疏松的分子作用机制具有较大的意义。

本研究收集到杜仲中具有抗骨质疏松作用的化学成分主要是槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、Mairin、olivil、Eucommin A、Cyclopamine、liriodendrin-qt、D6、D3、Helenalin、Yangambin、D1等。如杜仲中的槲皮素能使ERK磷酸化激活，促进骨髓间充质干细胞增殖[18]。山柰酚能够增加骨密度，使骨质疏松的骨微结构得到改善，其抗骨质疏松作用强于槲皮素[19]。

图8 杜仲“成分——靶标——通路”多维网络关系图Figure 8 The component-target-pathway network for Cortex Eucommiae

本研究发现，杜仲可能通过调节PTH、BGP、PPAR、ALP、RUNX2等靶标达到治疗骨质疏松的目的。如PTH可刺激骨形成、增大骨密度、改善骨质疏松微结构、逆转骨退化，而PTH类药物也已作为一种骨形成促进剂应用于原发性骨质疏松症的预防治疗[20]。BGP水平降低可影响骨代谢，加快骨吸收，进而对骨质疏松的发生产生影响[21]。PPAR即过氧化物酶体增长因子活化受体，其亚型PPARγ2与配体可调节脂代谢来影响骨代谢平衡，减少成骨细胞，导致骨质疏松[22]。骨ALP是骨形成中的一种主要功能酶，是骨形成、骨转换的标志物[23]。RUNX2为Runt基因家族里的转录因子，它可调节破骨细胞、成骨细胞和基质蛋白等的生理活动来影响骨质疏松的发生发展[24]。

本研究结果显示，杜仲治疗骨质疏松的过程可 能 涉 及 PI3K-Akt、 VEGF、 AMPK、 Notch、NF-κB、FoxO、HTLV-I等信号通路。PI3K/Akt信号通路是机体细胞生长、增殖与抗凋亡的一个重要调节因素[25]，有研究认为它可能是成骨细胞与破骨细胞增殖、分化、凋亡调控的中心，能影响骨转换的平衡[26]。VEGF是血管中的一种生长因子，可影响内皮、血管和骨骼的合成与生长，还可影响骨骼构成和骨骼替换[27]。AMPK是胞内能量感受器、能量与代谢平衡调节器，它也可调节骨组织代谢。AMPK可能通过成骨分化、骨吸收与破骨细胞活化等生理活动的调节，影响骨质疏松的发生发展[28]。Notch信号通路主要参与了机体的生长发育和细胞分化[29]。此信号通路的减弱常和绝经后骨质疏松女性的骨髓间充质干细胞增殖、分化能力减弱相关，可能是导致骨量降低的因素[30]。NF-κB是与多种炎症相关的转录因子，炎症细胞因子通过促进破骨细胞的生成与分化，导致了骨的生成与吸收之间的平衡，使得骨质减少加速，骨质减少，最终出现骨质增生或者骨折[31]。FoxO在骨代谢中通过减少成骨细胞中自由氧浓度提高抗氧化能力，同时可以促进成骨细胞分化，来预防骨质疏松[32]。HTLV-I感染后患者有20%～30%发生高钙血症，甲状旁腺相关蛋白（PTHrP）的产生是出现高钙血症的主要原因，由Tax反式激活PTHrP基因表达会促进骨质的分解，造成骨质疏松[33]。因此，杜仲可能通过PI3K-Akt、VEGF、AMPK、Notch、NF-κB、FoxO、HTLV-I等信号通路来调节骨细胞的各种生理活动，达到治疗骨质疏松的目的。

本研究通过网络药理学方法分析杜仲治疗骨质疏松的有效化学成分和作用机制，通过相关网络图的构建可直观地显示出杜仲治疗骨质疏松具有多成分，多层次，多途径共同作用的特点，符合中医药治疗疾病的特色，相比于西药的单一作用机制，其优势明显。分子对接模拟试验结果显示本次研究数据较为准确，具有较高的可信度。网络药理学分析结果也与现有研究结果基本一致。但利用网络药理学方法研究杜仲抗骨质疏松的机制，仅是基于分子机制的预测，后期我们将在此研究结果的基础上，借助学校动物实验中心以及附属医院为平台，开展进一步的动物实验以及临床试验研究，以验证其具体作用机制。